HPLC法测定大鼠静脉注射色胺酮的血药浓度及其药代动力学研究

吴青青， 黄和平， 汪电雷， 黄 鹏， 姚兆敏， 吴 洁， 方 伟

(安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012)

色胺酮主要来源为十字花科植物菘蓝 (IsatisindigoticaFortune)、爵床科植物马蓝 (Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)、豆科植物木蓝 (IndigoferatinctoriaLinn)、蓼科植物蓼蓝 (PolygonumtinctoriumAit)等，是吲哚喹唑啉类生物碱，其化学结构为吲哚并[2,1-B]喹唑啉-6,12-二酮，由于其在天然植物中含量极低，现多通过人工合成[1-2]。近年来对色胺酮的研究表明其具有抗菌[3]、抗炎[4-6]、抗肿瘤[7-10]以及抗寄生虫等药理活性，且有研究报道色胺酮毒性较低，安全性良好[11-12]，具有良好的研究与开发前景。目前，关于色胺酮的研究多报道其合成及临床应用和药理作用机制等，而对于大鼠体内的药代动力学研究较少，本试验建立HPLC法测定大鼠静脉注射色胺酮后血浆中的药物浓度，并考察在大鼠体内的药代动力学，为其进一步开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

LC-16高效液相色谱仪(日本岛津公司)，Milli-Q Gradient A10超纯水(Millipore Inc．USA)，AS5150A型超声清洗仪(Autoscience公司)，Vortex-genie 2涡旋混合器(美国 Scientific Industries公司)，Centrifuge 5804R台式高速离心机(上海东兢电子有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)。

色胺酮标准品(≥ 97%，批号SY017117，上海韶远科技有限公司)；乙腈(色谱纯)，N,N-二甲基甲酰胺(色谱纯，阿拉丁)，试验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验动物

SPF级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重200±20 g，由安徽中医药大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(皖) 2017-001，试验前12 h内，禁食不禁水。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent 5 HC-C18 (250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈-水(53∶47，v/v)，流速:1 mL/min，检测波长251 nm，柱温为30 ℃，进样量20 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取色胺酮1.0 mg于容量瓶中，加适量乙腈超声溶解，定容至刻度。精密吸取储备液，用乙腈稀释成浓度为0.6、1.5、3、6、15、20 μg/mL的对照品溶液[13-15]。

1.3.3 内标溶液的制备 精密称定内标物4(3H)-喹唑酮标准品1 mg置于10 mL量瓶，加适量乙腈超声溶解，定容至刻度，得内标储备液(100 μg/mL)，临用前精密吸取适量，用乙腈稀释成3 μg/mL的工作液于4 ℃保存备用。

1.3.4 生物样品处理及分析 取血浆100 μL置于1.5 mL EP管中，加入10 μL内标工作液，然后加入250 μL乙腈沉淀蛋白，于涡旋混合器上混匀3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，进样20 μL，采用建立的HPLC方法进行检测分析。

1.4 药代动力学实验

取6只SD大鼠，试验前禁食12 h，自由饮水。尾静脉注射色胺酮药液75 mg/kg(以色胺酮计)，按5 mL/kg体积注射。分别在给药前和给药后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h于眼眶取血0.5 mL放置在1.5 mL肝素化EP管中，-20 ℃冷冻保存，备用。按1.3.4节下步骤处理，20 μL进样分析。

2 结果与分析

2.1 专属性试验

取空白血浆，空白血浆加对照品溶液和单剂量尾静脉注射色胺酮0.083 h后大鼠血浆按1.3.4节下方法处理后，在1.3.1色谱条件下进样测得的血浆样品色谱图如图1，结果表明在该色谱条件下，色胺酮与内标物出峰时间保留时间恰当，且各峰分离度良好没有杂峰干扰。

注：A.空白血浆；B.空白血浆加内标物4(3H)-喹唑酮(1 μg/mL)；C.空白血浆加色胺酮(1 μg/mL)；D.静脉注射给药0.083h含药血浆，1.4(3H)喹唑酮；2：色胺酮

2.2 线性范围及定量下限

分别取大鼠空白血浆90 μL置于1.5 mL EP管中，分别加入10 μL一系列混合标准溶液配制成血浆中色胺酮浓度为0.06、0.15、0.3、0.6、1.5、2 μg/mL，按1.2.4节下操作，以1.3.1节下色谱条件进样分析。以血浆中色胺酮的质量浓度为横坐标(x)，以色胺酮峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，用最小二乘法回归运算，得到直线回归方程：Y=13.711x-0.389 5。结果表明，色胺酮在0.06～2 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 精密度与准确度

取大鼠空白血浆90 μL，加入0.6、1.5、3、15 μg/mL的对照品溶液各10 μL配制定量下限、低、中、高浓度(0.06、0.15、0.3、1.5 μg/mL)的质控样品，每个浓度平行做5份，重复3个分析批，按血浆处理方法处理，以1.3.1节下色谱条件进样分析，记录血浆样品中每个药物的峰面积Ax。以当天随行标准曲线分别计算每个样品的实测浓度。各分析批样品以该分析批内制备的随行标准曲线分别计算其实测浓度，连续测3 d(表1)。

表1 精密度和准确度测定结果(n=5)

2.4 稳定性

按2.3节配制浓度为低、高三种浓度的含药血浆样品，每种浓度平行3样本，按1.3.1节下色谱条件进样分析，分别考察样品反复冻融3次、室温放置4 h、长期放置-20 ℃冰箱冻存两周以及反复冻融3次的稳定性如表2。

表2 稳定性测定结果 (n=3)

2.5 提取回收率

取大鼠空白血浆90 μL，分别加入1.5、3、15 μg/mL三种浓度标准品溶液各10 μL制备低、中、高(0.15、0.3、1.5 μg/mL)三种浓度的质控样品，每个浓度平行5份，按1.3.4节下方法处理，进样分析，记录血浆样品中每个药物的峰面积As(H)。同时取90μL空白血浆，以空白血浆与乙腈1∶2.5(v/v)制备空白血浆上清液，分别加入标准品溶液制备相同低、中、高浓度的含空白血浆的色胺酮对照品溶液，分别进样测定,记录样品中每个药物的峰面积As(D)。回收率=As(H)/As(D)平均值×100%,计算得到此方法下色胺酮的提取回收率。每个浓度平行做5份。结果表明，提取回收率均>85%，RSD<10%，符合生物样品分析方法验证要求。

2.6 药物动力学

大鼠静脉注射色胺酮后平均血药浓度-时间曲线如图2。用 DAS 3.0软件对数据进行分析，计算药动学参数结果见表3，在体内符合二室模型特征。

图2 大鼠静脉注射色胺酮后血浆中平均血药浓度-时间曲线(X±S, n=6)

参数单位MeanSDt1/2αh0.1330.168t1/2βh2.1930.971V1L/kg33.79427.797CLL/(h·kg)29.7627.98AUC(0-t)mg/(L·h)4.2883.089AUC(0-∞)mg/(L·h)4.6163.307K101/h44.36467.785K121/h18.72619.864K211/h1.8021.413

3 结论与讨论

本试验考察甲醇-水，乙腈-水的不同比例流动相，比较结果表明乙腈-水(53∶47，v/v)作为流动相最为合适，该条件下内标与色胺酮保留时间合理，且互不干扰，峰形良好，血浆内源性物质不干扰实验结果。在内标的选择上根据有关文献资料选取与色胺酮结构相似的4(3H)-喹唑酮[16-18]，其在优化的色谱条件下与色胺酮的分离度及峰形均良好，在波长的选择上比较不同波长下色胺酮的吸收，结果表明在251 nm波长下，色胺酮吸收最大。生物样品处理采用乙腈沉淀蛋白，样品的内标峰与目标峰分离度良好且无杂质干扰。静脉注射色胺酮药物后,t1/2β为2.193 h，AUC(0-∞)4.616 mg/(L·h)，V1为33.794 L/kg，CL 29.76 L/h/kg,表明色胺酮在大鼠体内吸收、代谢过程较快，在体内分布广泛。