以皂苷含量为指标优化冬瓜籽提取工艺

夏平友, 张 全, 肖同梅, 倪贤华, 刘学风, 张新勇

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

冬瓜籽是葫芦科植物冬瓜干燥成熟的种子[1]，其味甘，性微寒[2]。冬瓜籽营养丰富且有很高的药用价值，具有清热化痰等效果[3-4]。冬瓜籽中含有皂苷等物质，具有抗氧化等作用[5]，研究显示皂苷具有抑制血小板聚集，降低血脂等作用[6]，棘孢曲霉菌株可以经过诱导产生白头翁皂苷糖苷酶[7]。半仿生法主要通过模拟胃、小肠、大肠内环境酸度来模仿药物在机体内转运原理提取药物中活性成分[8]。国内关于半仿生法对冬瓜籽中主要药效成分的提取工艺研究较少，故本文在半仿生法的基础上用正交试验法优化冬瓜籽中皂苷提取工艺，为冬瓜籽相关研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

仪器：HH-6恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；HDM-1000D搅拌电热套(江苏省荣华仪器制造有限公司)；UV-1601紫外可见分光光度计(北京分析瑞利仪器有限公司)；LE204E/02电子天平(上海书培实验有限公司)。试剂：所用试剂均为分析纯(天津市致远化学试剂有限公司)。材料：人参皂苷Rb1(上海源叶生物有限公司，批号：B21051)；冬瓜籽(单边，安徽亳州)。

1.2 试验方法

1.2.1 对照液配制 精密称定人参皂苷Rb1对照品15.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中。

1.2.2 对照液吸光度测定 向20 mL具塞试管中分别加入对照液0、0.15 mL，75 ℃水浴挥干溶液，分别加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反应15 min，再放入冰水充分冷却后加入冰醋酸5.0 mL，摇匀后静置4 min，以相同溶剂在相同操作下作为空白对照，由扫描结果可知在551 nm处较好。另取7支20 mL试管分别加入0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL对照液，在551 nm测吸光度,以横坐标为对照液浓度C,纵坐标为吸光度y绘制标准曲线，并计算R2。

1.2.3 待测液配制 将冬瓜籽粉碎过12目筛，称定9份冬瓜籽粉，每份精密称定5.000 0 g。根据半仿生法模拟人体内部消化环境，人体胃中下部pH值为1.0～2.0，大肠和小肠pH值为4.0～7.0，十二指肠pH值为7.0～8.5，以水作为提取溶剂，分别在不同温度、时间、液料比下对同一份冬瓜籽粉加热回流提取3次，总时间比为2∶1∶2，每次过滤后保留滤渣，并用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液依次调节pH值为2.0、6.0和7.5，合并3次提取液，浓缩定容到500 mL容量瓶并编号待测液1～9号。

1.2.4 待测液皂苷含量测定 从1～9号容量瓶各吸取待测液1.0 mL并在70 ℃水浴挥干溶剂后用甲醇溶解，经过滤后将滤液移至2.0 mL容量瓶中并用甲醇稀释至刻度，从中移取0.40 mL至20 mL试管中，测定吸光度y，计算求得皂苷含量(mg/g)。

1.2.5 加样回收试验 从已知冬瓜籽皂苷含量1～5号待测液中每份吸取1.0 mL，分别加入对照液0.10 mL,在1.2.4节下按相同方法处理，测定吸光度y并代入标准曲线方程求得皂苷含量(mg/g)，结果表明该法正确、稳定。

1.3 单因素试验

1.3.1 提取温度考察 分别称取5份5.000 0 g冬瓜籽粉于500 mL圆底烧瓶中，液料比为1∶20，提取总时间90 min，在一系列温度(60、70、80、90、100 ℃)条件下用缓冲液调节最终pH值分别为2.0、6.0、7.5，按1.2.2节下处理，在1.2.4节下测定皂苷含量(mg/g)。

1.3.2 提取时间考察 取5个500 mL圆底烧瓶分别加入5份5.000 0 g冬瓜籽粉，在液料比、提取温度分别为1∶20和90 ℃时，在一系列提取时间(90、120、150、180、210 min)条件下,用PBS缓冲液调节最终pH值为2.0、6.0、7.5，按1.2.2节下处理，在1.2.4节下测定皂苷含量(mg/g)。

1.3.3 液料比考察 称取5份冬瓜籽粉，每份5.000 0 g分别置于500 mL圆底烧瓶中，设定提取温度为90 ℃，提取总时间为180 min，在一系列液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)条件下用PBS缓冲液调节最终pH值为2.0、6.0、7.5，在1.2.4节下测定皂苷含量(mg/g)。

1.4 正交试验设计

在其他条件相同情况下，以冬瓜籽皂苷含量为指标考察提取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)对冬瓜籽皂苷提取率的影响，采用L9(34)正交表进行试验设计(表1)。

表1 冬瓜籽皂苷单因素试验设计

2 结果与分析

2.1 对照品吸收曲线及标准曲线的绘制

向20 mL具塞试管中分别加入对照液0、0.15 mL，75 ℃水浴挥干溶液，分别加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反应15 min，再放入冰水充分冷却后加入冰醋酸5.0 mL，摇匀后静置4 min，以相同溶剂在相同操作下作为空白对照，扫描间隔为1 nm，结果见图1。确定最佳吸收波长为551 nm。分别取对照液0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL按相同预处理在551 nm处测定吸光度。以纵坐标为吸光度y，横坐标为浓度C，绘制标准曲线，方程为y=19.001C-0.075 1，R2=0.999 6(图2)。

图1 吸收曲线

图2 人参皂苷Rb1标准曲线

2.2 不同因素对皂苷提取率的影响

2.2.1 提取温度对皂苷含量的影响 在温度较低时皂苷溶解度不高，溶液中皂苷含量不高，当温度超过一定时，溶液副反应程度增大导致皂苷含量偏低，故呈现先上升后下降的趋势(图3)。

图3 提取温度

2.2.2 提取时间对皂苷含量的影响 当提取时间较短时，冬瓜籽中皂苷成份提取不完全，其含量随着时间的增大而增大，但当提取时间过长时，皂苷会在强酸、强碱环境下发生降解，导致皂苷含量降低，所以皂苷含量随着时间的增大其含量先上升后下降(图4)。

图4 提取时间

2.2.3 液料比对皂苷含量的影响 当提取溶剂较少时，皂苷提取速率会降低，导致皂苷含量较低，当提取溶剂较多时皂苷提取速率也会随之增大，所以当液料比增大时，皂苷含量也会随之增大最后趋于稳定(图5)。

图5 液料比

2.3 正交试验设计

由上述试验结果可以得出，当提取温度为90 ℃，提取时间为180 min,液料比为1∶20时皂苷提取得率较好。为确定半仿生法优化冬瓜籽皂苷提取最佳试验条件，采用L9(34)正交试验表，以冬瓜籽皂苷含量为指标进行试验(表2～3)。

表2 冬瓜籽皂苷正交试验表

表3 冬瓜子皂苷正交试验方差分析表

注:〔*〕表示在F[0.05]显著；〔**〕表示在F[0.01]显著。

由极差分析可以得出各自影响因素强弱为RC>RA>RB，故最优组合为C2、A2、B3，即液料比为1∶20,时间为180 min,温度为90 ℃。

3 结论与讨论

半仿生法通过模拟机体内部环境，模仿药物在机体内的转运过程[9]，并且在酸性和碱性环境下提取可以使有效成分损失较少[10]。酸或碱能破坏磷脂双分子层结构，能让细胞壁进一步水解，故能够提高提取效率[11]。本文用半仿法和正交试验优化冬瓜籽中皂苷提取工艺[12]。通过单因素试验确定各因素最佳考察范围。从温度和时间对冬瓜籽皂苷含量影响的单因素试验可以看出，其浓度随着温度和时间的增大先上升后下降，在提取温度较低时冬瓜籽皂苷随着温度的增大其溶解度增大故皂苷含量增大，但当温度过高时皂苷含量降低较为明显，这可能是冬瓜籽皂苷在高温时发生降解和转化[13]，冬瓜籽皂苷中含有亲水性基团，从而使其在浓度随时间的增加而增大，但在此试验环境下通过缓冲液调节pH值至强酸性或弱碱性，而强酸性、弱碱性环境可以使皂苷降解，随着时间的增加其含量降低，故提取率呈现先上升后下降趋势。随着液料比的增加，皂苷含量先上升后保持不变，在强酸碱环境中可以促进植物细胞壁水解，故当提取时间、温度一定时，皂苷含量随着液料比的增加先上升后基本不变。对最佳试验范围用正交试验优选最佳提取工艺，结果显示当液料比为1∶20、提取时间和温度分别为180 min、90 ℃时，皂苷提取得率达0.52%。半仿生法提取优化一种冬瓜籽皂苷最佳提取工艺操作简单结果稳定可靠。