小檗碱改善血管性痴呆大鼠学习记忆与P38MAPK 通路的关系

秦鹏飞 谈陈界 柴松琦 严嘉宁 赵立峰 韦登明

(宁波大学医学院病理教研室,浙江 宁波 315211)

血管性痴呆(VD)是主要由缺血性脑血管疾病导致的认知障碍综合征。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1作为炎性趋化蛋白，在VD的脑组织炎性损伤中起了重要的作用。P38丝裂原活化蛋白激酶级联途径(P38MAPK通路)和脑缺血再灌注损伤密切相关〔1,2〕，主要参与了炎性应激反应，但是否参与MCP-1介导的VD脑损伤，少见文献报道。小檗碱能够减弱炎症递质释放，抑制炎症细胞的分化和趋化，从而产生抗炎作用〔3〕。而小檗碱改善VD患者认知功能的机制是否与小檗碱影响MCP-1和P38MAPK表达有关，目前尚未有相关研究。本实验通过检测小檗碱对VD大鼠海马区MCP-1和P38MAPK蛋白含量的影响，研究其对VD学习记忆的改善效果及相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康清洁级Wistar大鼠60只，体重200～250 g，雄性，由宁波大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(浙)2013-0191。大鼠自由饮食，适应性喂养7 d后，分为正常组，假手术组，模型组和小檗碱低、中、高剂量组，每组10只。

1.2试剂仪器 小檗碱(阿拉丁试剂上海有限公司)，水迷宫程序自动控制仪(上海移数动物学系统)；兔抗大鼠P38MAPK、MCP-1 多克隆抗体，生物素化羊抗兔 IgG、SABC 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；JD801形态学图像分析系统(江苏捷达科技发展有限公司)，BM-Ⅶ包埋机(宏业医用仪器公司)；HM-325石蜡切片机(德国LEICA公司)；CX40生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.3模型制备 采用王蕊等〔4〕的方法稍加改进后造模。10%水合氯醛按35 mg/kg进行腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰卧固定，切开颈部正中皮肤，钝性分离，暴露右侧颈总动脉(CCA)，随即分离CCA(同时分离迷走神经)，然后穿线。将硝普钠按3.5 mg/kg的剂量腹腔注射以降低血压。CCA用动脉夹夹闭30 min，随即再通1 h，再次夹闭30 min。碘酒消毒后缝合，放回到鼠笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不夹闭CCA。术后，每只大鼠连续3 d肌肉注射青霉素16万U。饲养7 d后，按Longa 5分法标准进行评判，2分及以上为造模成功大鼠。

1.4给药方法 小檗碱各剂量组造模前持续给药7 d，每日1次，按150 mg/kg(高剂量组)、100 mg/kg(中剂量组)、50 mg/kg(低剂量组)的剂量腹腔注射；模型组和假手术组、正常组在同样的时间点注射1 ml/100 g生理盐水。造模后小檗碱各剂量组仍予小檗碱治疗，共14 d，按150 mg/kg(高剂量组)、100 mg/kg(中剂量组)、50 mg/kg(为低剂量组)腹腔注射，1次/d；模型组、假手术组和正常组同时给予腹腔注射1 ml/100 g的生理盐水。

1.5行为学检测 采用Morris水迷宫试验〔5〕，共计5 d，每天早晨检测一次，将各组大鼠分别从两个入水点面向池壁放入水中，记下大鼠在90 s内游上平台的时间(逃避潜伏期)，以此来检测其学习能力。

1.6海马神经元凋亡形态学观察 以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，断头取脑，置于冰盘，分离海马体。常规脱水、用石蜡包埋，含海马连续切片，苏木精-伊红(HE)染色。每例取3张切片，尽量使每张切片断面相似，随机选择10个海马CA3区，高倍镜(40×10倍)下计数神经元凋亡数目，计算凋亡细胞所占的百分比〔6〕。

1.7免疫组织化学方法检测P38MAPK通路蛋白和MCP-1表达 石蜡包埋切片后进行免疫组织化学染色。切片经常规脱腊、脱水、3%H2O2灭活内源性酶、微波抗原修复，小心洗涤，使用正常山羊血清封闭，分别滴入一抗P38MAPK(1∶500)和MCP-1(1∶100)，置于湿盒中4℃冰箱环境过夜。滴加二抗为生物素化羊抗兔IgG，进行SABC反应和二氨基联苯胺(DAB)显色。最后经复染、脱水、透明、封片，于光镜下进行免疫组化染色观察，胞质呈红褐色为阳性区域。光镜(40×10倍)下随机选取每张切片的4个视野，计算平均积分光密度。

1.8统计学处理 采用SPSS13.10软件行单因素方差分析，两组间数据比较采用SNK检验。

2 结 果

2.1小檗碱对各组大鼠行为学表现的影响 随着训练天数的增加，各组均出现逃避潜伏期明显缩短的情况，相比于正常组，假手术组的逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组的逃避潜伏期明显增加(P<0.05)；而小檗碱各剂量组较模型组的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，且随小檗碱剂量增大，大鼠的逃避潜伏期显著缩短，存在剂量依赖现象。见表1。

表1 各组水迷宫试验不同时间点逃避潜伏期

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与高剂量组比较：3)P<0.05；与中剂量组比较：4)P<0.05；下表同

2.2小檗碱对各组大鼠海马神经元凋亡的影响 正常组和假手术组大鼠海马神经元正常，未见明显凋亡，神经元凋亡率分别为(2.22±0.72)%、(1.78±0.17)%。模型组大鼠海马存在大量凋亡细胞，神经元凋亡率为(51.67±8.04)%；经小檗碱治疗后，各治疗组大鼠海马神经元凋亡明显减少，高、中、低剂量组神经元凋亡率分别为(34.11±2.40)%、(40.23±4.45)%、(44.40±4.96)%，与模型组比较差异显著(P<0.05)。

2.3小檗碱对各组大鼠海马P38MAPK和MCP-1表达的影响 在正常组与假手术组，大鼠的海马神经细胞仅见少量P38MAPK和MCP-1阳性表达。模型组比假手术组P38MAPK和MCP-1表达明显增加(P<0.05)。经小檗碱治疗后，与模型组相比，各剂量组海马神经细胞P38MAPK和MCP-1的阳性表达明显减少(P<0.05)，见表2。

表2 小檗碱对各组海马P38MAPK和MCP-1表达的影响积分光密度)

3 讨 论

脑缺血引起行为学障碍是当前进行VD研究的最常用的经典造模方法。本研究采用阻断动脉的方法制作VD模型，经过Morris水迷宫试验证明模型组大鼠学习能力明显减弱，表明本次造模成功〔7〕。MCP-1在VD脑组织的炎性损伤中扮演了重要角色，MCP-1 的大量表达直接关系到脑缺血损伤后单核细胞聚集和神经胶质细胞活化，胶质细胞活化后可产生自由基，通过神经毒素的释放间接造成缺血脑损伤，导致神经细胞变性和坏死〔8〕。P38MAPK通路与脑缺血再灌注中神经细胞大量损伤有着密切联系。VD会导致P38MAPK激活,而抑制P38MAPK的作用能有效保护神经细胞免受缺血再灌注损伤。小檗碱也称黄连素,是一种四氢异喹啉类生物碱,可以减少炎症介质如MCP-1的释放并抑制其趋化，从而减轻局部炎症反应〔9〕，这对减弱神经元坏死凋亡、保护大脑的认知能力起到了至关重要的作用。魏佑震等〔10，11〕证实小檗碱对脑缺血后再灌注损伤的海马CA1区神经元有保护作用。本研究表明小檗碱对VD大鼠的学习记忆能力有改善作用，能保护VD大鼠大脑的海马区神经元。免疫组织化学试验结果显示小檗碱治疗后MCP-1和P38MAPK表达明显降低，因此，笔者认为MCP-1和P38MAPK的高表达参与了VD脑损伤过程，而小檗碱可能通过对MCP-1和P38MAPK表达的抑制对大鼠海马区神经元产生保护作用，从而增强VD大鼠的学习记忆能力。