柚皮素联合Bcl-2抑制剂ABT-263调控信号通路AKT对胃癌细胞增殖凋亡的影响

叶群立 张洋洋 罗金健

(郑州大学附属郑州中心医院 1急诊科，河南 郑州 450000；2消化内科)

柚皮素(Nar)是一种广泛存在于西红柿、葡萄和枳实等芸香科植物中的黄酮类化合物。研究表明，Nar对乳腺癌、胃癌、肺腺癌等多种肿瘤〔1～6〕的发生发展具有很好的抑制作用。ABT-263是一种BH3类似物的Bcl-2抑制剂〔7〕，对乳腺癌〔8〕、肝癌〔9〕和肺癌〔10〕等具有很好的抗肿瘤作用，然而在胃癌细胞中的作用未见报道。本实验通过Nar和ABT-263的联合用药，探讨其对胃癌细胞增殖凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 人胃癌细胞株SGC7901购于上海慧颖生物科技有限公司；Nar、ABT-263、噻唑蓝(MTT)检测试剂盒、胎牛血清和RPMI1640培养基均购于美国Sigma公司；Western印迹所用试剂均购自上海Bio-Rad公司，β-actin(内参)单克隆抗体、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT多克隆抗体均购自上海Santa Cruz公司。酶标仪和恒温CO2培养箱分别来自美国Dynex technologies公司和美国Thermo公司，流式细胞仪和膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒均购自南京凯基生物公司。

1.2细胞培养 将人胃癌细胞株SGC7901培养在RPMI-1640培养液(含有10%的胎牛血清，1%的谷氨谷氨酰胺及抗生素)中，细胞密度调整为1×104个/ml，在37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养2 d，0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT法检测细胞增殖抑制作用 取经胰酶消化处理的上述对数期生长的细胞，制备SGC-7901细胞悬液，按照1×104个/孔接种于96孔培养板中，培养24 h后分别加入处理液Nar和ABT-263抑制剂，Nar组浓度分别为 0、30、60、90、120 μmol/L，ABT-263组浓度依次为 0、5、10、15、20 μmol/L，均以0 μmol/L为对照组；同时以60 μmol/L Nar+5 μmol/L ABT-263抑制剂为联合用药组，在常规条件下依次培养24、48、72 h后，加入5 mg/ml MTT溶液，4 h后采用酶标仪在450 nm波长下测其吸光值(A)，根据公式计算增殖抑制率(%) =1-A处理组/A对照组×100%。各浓度设3个复孔，每个处理重复3次。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡 将浓度为5×105个/ml生长期细胞接种于6孔板中，共设4组，分别为对照组、Nar组、ABT-263组及联合用药组，其中Nar浓度为60 μmol/L，ABT-263的浓度为5 μmol/L。培养24 h，待完全贴壁后，向各处理组中加入药物处理48 h后，用0.25 %的胰酶消化细胞，离心，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入5 ml RPMI-1640培养基制成细胞悬液。取100 μl细胞悬液各加入5 μl Annexin V-FITC和PI，避光处理10 min，流式细胞仪法上机检测凋亡率。每组实验均重复3次。

1.5Western印迹检测AKT相关蛋白的表达 收集1.4中药物处理48 h后的各组细胞，PBS洗涤后，加入细胞裂解液，放置15 min，低温高速离心，吸取上清液，用紫外分光光度计测量蛋白浓度。取各组等量的蛋白，加入缓冲液摇匀，进行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。采用半干转法转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭1 h后将膜与AKT、p-AKT一抗(1:200)置于4℃孵育过夜。加入二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，TBST洗膜，使用Western曝光仪显影，并用灰度分析软件Quantity One v4.62进行分析蛋白表达强度。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1Nar和ABT-263对SGC7901细胞增殖的抑制作用 随Nar作用浓度增大及作用时间延长，对SGC7901细胞的增殖抑制率均显著增加(P<0.05)，见表1。随ABT-263作用浓度增大及作用时间延长，对SGC7901细胞的增殖抑制率均显著增加(P<0.05)，见表2。与对照组比较，Nar组、ABT-263组及联合用药组细胞的增殖抑制率均显著增加(P<0.05)；与Nar组和ABT-263组比较，联合用药组细胞的增殖抑制率均显著增加(P<0.05)。见表3、图1。

表1 不同浓度Nar作用下不同培养时间SGC7901细胞增殖抑制率的比较

同一时间与前一浓度比较：1)P<0.05;同一浓度与前一时间比较：2)P<0.05;表2同

表2 不同浓度ABT-263作用下不同培养时间SGC7901细胞增殖抑制率的比较

表3 不同培养时间各组SGC7901细胞增殖抑制率比较

与对照组比较：1)P<0.05;与联合用药组比较：2)P<0.05;表4同

图1 Nar和APG-1252处理48 h的细胞凋亡图

2.2各组细胞凋亡率比较 Nar组〔(29.58±2.10)%〕和ABT-263组细胞凋亡率〔(15.82±1.02)%〕均较对照组显著升高〔(5.65±0.13)%，P<0.05〕，联合用药组凋亡率〔(58.32±3.45)%〕显著高于Nar组及ABT-263组(P<0.05)。见图1。

2.3各组AKT相关蛋白的表达 与对照组比较，Nar组、ABT-263组及联合用药组p-AKT蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与Nar组和ABT-263组比较，联合用药组p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。各组AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图2。

表4 各组AKL、p-AKT蛋白表达比较

1：对照组；2：Nar组；3：APG-1252组；4：联合用药组图2 信号通路AKT相关蛋白的表达

3 讨 论

胃癌的发生在早期并不易被察觉也没有特异性症状，一旦发现就诊时多为晚期。随着老龄化的加剧，癌症的防止和治疗也越来越迫切〔11，12〕。研究发现，青年人中胃癌的发病率逐渐上升〔13〕，Nar是一种油皮苷的苷元，具有广泛的抗菌、抗癌、抗肿瘤等药理活性，由于其本身水溶性、脂溶性特点的限制对其研究还处在临床应用上。随着科学技术的发展，近年来在胃癌方面的基础研究也取得了显著的进展，中药、西药和抗肿瘤抑制剂间相互联合用药的研究〔14～18〕已成为研究的热点。

研究发现，Nar可通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路中PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-31的活性来促进乳腺癌的凋亡〔4〕；阻断细胞周期并调节AKT及核因子(NF)-κB信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖〔19〕；通过下调基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达抑制胃癌细胞的增殖和侵袭〔20〕。ABT-263作为Bcl-2抑制剂的第二代可口服的抗肿瘤药物，在临床试验中对多种癌症的治疗效果非常优异〔21〕，与髓细胞白血病基因(MCL)-1不表达或微弱表达关系密切。

本实验的结果显示：经Nar或ABT-263的不同浓度和不同作用时间处理的SGC7901细胞均显示增殖抑制作用，且呈剂量-时间依赖性。联合用药后表现出协同作用。两药联用后的细胞凋亡率高于Nar或ABT-263单用。Nar联合ABT-263处理48 h的AKT信号通路相关蛋白的表达，与Nar、ABT-263单用相比，p-AKT表达水平进一步下降，而AKT表达受影响不明显。研究说明，Nar和ABT-263均可通过下调p-AKT抑制AKT信号通路，进一步达到抗癌的作用。

综上，Nar和ABT-263对胃癌细胞均有增殖抑制作用和凋亡促进作用，同时两者联用具有一定的协同增效的作用，且其作用与下调p-AKT抑制AKT信号通路有关。