甲状腺素对大鼠海马细胞凋亡和AMPA、NMDA受体的影响

谢奇伟 方绅哲 唐文昱 施晨洁 赵晶 韦登明

(宁波大学医学院病理学系，浙江 宁波 315211)

甲状腺功能亢进症(甲亢)是由于过多的甲状腺激素释放导致心脏、肌肉、大脑等多器官的损伤的疾病，其可导致机体的学习记忆力减弱，但具体机制尚不清楚〔1〕。研究表明〔2～4〕，机体的学习记忆的改变与海马细胞的凋亡及谷氨酸受体〔α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)〕表达变化有关。但目前国内外尚未见甲亢导致的机体学习记忆力降低是否与海马细胞的凋亡及AMPA受体和NMDA受体表达变化有关的报道。本研究在建立甲亢大鼠模型基础上，旨在研究甲状腺素对大鼠海马细胞凋亡和AMPA、NMDA受体的影响。

1 材料和方法

1.1实验材料 健康清洁级SD大鼠20只由宁波大学实验动物中心代购于浙江省动物中心，合格证号0102016，体重(200±10)g，雄性。随机分为对照组、甲亢组，每组各10只。兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗体(博士德生物有限公司)；兔抗鼠AMPA、NMDA抗体(博士德生物有限公司)；L-甲状腺素粉剂和羧甲基纤维素钠(美国Sigma公司)；山羊抗兔Ⅱ抗(中杉金桥有限公司)。BM-Ⅶ包埋机(宏业医用仪器公司)；HM-325石蜡切片机(德国LEICA公司)；CX40生物显微镜(日本Olympus公司)；JD801形态学图像分析系统(江苏捷达科技发展有限公司)；RM6240生物信号采集系统。

1.2动物模型的建立 模型参照文献方法〔5，6〕并进行改良后建立。将L-甲状腺素0.1 g/L混悬于5 g/L羧甲基纤维素钠中，置于冰箱保存待用，使用前充分摇匀。甲亢组大鼠每天腹腔注射L-甲状腺素0.5 mg/kg连续35 d，对照组腹腔注射等体积的羧甲基纤维素钠溶液。大鼠均喂常规固体饲料及瓶装饮用水。

1.3标本采用与制取 L-甲状腺素腹腔注射给药35 d，成功制备甲亢大鼠模型。将大鼠用水合氯醛麻醉后，开颅取含有海马的脑组织块置10%甲醛中，固定、脱水、浸蜡、包埋后制成石蜡切片。进行 HE染色和免疫组织化学染色。

1.4血清三碘甲腺原氨酸(T3)、血清总甲状腺素(T4)含量的检测 提取大鼠心血5 ml，用放射免疫分析法测定血清中T3、T4含量，实验方法严格按照说明书操作。

1.5Morris水迷宫检测 采用Morris水迷宫试验〔7〕：(1)定位航行：连续5 d早晨将大鼠各从2个入水点面向池壁放入水中，记下大鼠在90 s内游上平台的时间(即逃避潜伏期)，通过它来检测其学习力；(2)空间探索：第6天拆除平台，将其各从2个入水点面向池壁放入水中，记录大鼠90 s时间内在平台所在象限的总共停留时间。

1.6免疫组化检测Bax、Bcl-2蛋白、AMPA、NMDA受体的表达 石蜡切片常规脱蜡，在3%过氧化氢(H2O2)中室温孵育，0.01 mmol/L枸橼酸溶液高温抗原修复，使用正常山羊血清封闭，滴加抗Bax(1∶50)、Bcl-2(1∶50)、AMPA(1∶400)、NMDA(1∶400)抗体免疫组化染色，置于湿盒中4℃冰箱环境过夜。滴加二抗，进行链霉亲和素-生物复合物(SABC)反应和二氨基联苯胺(DAB)显色。苏木素复染脱水透明封片。在400倍光镜下，每张切片在海马CA1区随机选取5个视野进行检测〔8〕，分别计算Bax、Bcl-2和AMPA、NMDA受体平均积分光密度。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组血清T3、T4水平比较 与对照组比较，甲亢组血清T3、T4水平明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 两组血清T3、T4水平比较

与对照组比较：1)P<0.01；表3同

2.2两组逃避潜伏期比较 随着训练天数的增加，各组大鼠的平台潜伏期明显缩短(P<0.05)。与对照组比较，第3～5天甲亢组逃避潜伏期明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 两组逃避潜伏期

与对照组比较：1)P<0.05；组内与前一时间点比较：2)P<0.05

2.3两组海马Bax、Bcl-2、AMPA、NMDA受体的表达 与对照组比较，甲亢组海马Bax蛋白表达明显增高(P<0.01)；Bcl-2蛋白及AMPA受体和NMDA受体的表达明显降低(P<0.01)。见表3、图1。

表3 两组Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受体表达

图1 海马Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受体的表达(免疫组化，×400)

3 讨 论

Bcl-2家族是细胞内凋亡调控常用的凋亡表达基因，包括Bcl-2基因和Bax基因。研究表明〔9～12〕，Bax、Bcl-2 蛋白的表达和两者之间的比例关系是决定细胞凋亡的关键因素。Bcl-2蛋白可以通过调节Ca2+浓度、降低细胞膜通透性、减少细胞色素C的释放，起到抑制细胞凋亡的作用。而Bax 基因对Bcl-2 具有拮抗作用，它编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体。本研究结果表明，甲亢大鼠在学习记忆方面有明显的减弱；长期高浓度的甲状腺素可能通过增加Bax蛋白的表达，减少Bcl-2蛋白的表达促进细胞凋亡从而导致记忆力降低。

研究表明〔12～15〕，长时程增强(LTP)和长时程抑制是海马正常工作的基础。它依赖于AMPA受体和NMDA受体的表达。高频刺激使突触前膜释放的谷氨酸递质，与突触后膜上的AMPA受体结合使突触后膜去极化。突触后膜去极化达到一定程度后，NMDA受体通道内的Mg2+移开，使 Ca2+内流，触发一系列生化反应，导致LTP的产生。本研究结果提示长期高浓度的甲状腺素可能通过减少AMPA受体和NMDA受体的表达从而导致记忆力降低。