环磷酰胺建立SD大鼠卵巢功能减退模型的研究*

李丽美，陶莉莉，和秀魁，陈小平，孙冬梅，陈玉兴，夏建红

(1.广东省妇幼保健院妇保科，广州 510095；2.广州中医药大学第一附属医院妇科，广州 510405；3.广东省妇幼保健院妇科，广州 510095；4.广东省中医药工程技术研究院，广州 510095)

卵巢功能减退(DOR)是一种临床表现多样、病因复杂且进行性发展的疾病。它指既往正常的卵巢产生卵子的能力减弱，卵泡的质量下降。引起DOR的病因很多，化疗是目前已经明确的病因。环磷酰胺(CTX)是引起卵巢功能损害最大的化疗药物之一。临床上长期周期性使用CTX，可引起月经不调、闭经、早发性卵巢功能不全(POI)或卵巢早衰(POF)，停药后一段时间月经可恢复，恢复的时间与用药剂量和化疗的时间有关。本研究采用适当剂量的CTX建立SD雌性大鼠DOR模型，以供实验研究使用。

1 材料与方法

1.1主要材料

1.1.1实验动物 SPF级Spragne-Dawley(SD)成年大鼠，雌性，鼠龄12周，体质量(230±10)g，由广东省医学实验动物中心提供，实验设施合格证号和动物合格证号分别为SCXK(粤)2013-0002和NO.44007200002182。本实验SPF级动物实验室设施使用许可证号：SYXK(粤)2010-0059。

1.1.2实验仪器 JJ2000动物电子秤，BS224S万分之一电子天平，Bio-RAD 680酶标仪，YD62 型石蜡包埋机，Leica RM2235轮式切片机，Leica TP 1020型全自动脱水机，YD-AB型摊烘烤片机，YD-6L型智能冰冻包埋机，Shandon Gemini染色机，DHG-9203型电热恒温干燥鼓风干燥箱，Olympus DP2-BSW型病理图像采集系统，702超低温冰箱。

1.1.3实验药物 注射用CTX(每支0.2 g，购自山西普德药业有限公司，批号04130301)。0.9%生理盐水，每支10 mL。雌二醇(E2)ELISA试剂盒(批号1306246)，促卵泡激素(FSH)ELISA试剂盒(批号1306251)，促黄体生成素(LH)ELISA试剂盒(批号1304252)，抗苗勒氏激素(AMH)ELISA试剂盒(批号1304171)，抑制素B(INHB)ELISA试剂盒(批号1304261)，均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法 给予大鼠标准光照(14 h光照，10 h黑夜)，全价颗粒饲料喂养，自由摄食，室温20～25 ℃，相对湿度45%～55%。适应性喂养7 d，行阴道脱落细胞涂片观察其性周期变化，选取动情周期为4～5 d的大鼠120只开展实验。将动物分为G1组(生理盐水组，即空白对照组)和G2组，每组60只。参照刘惠芬等[1]的方法对G2组大鼠予CTX腹腔单次注射造模(按CTX 75 mg/kg的剂量加0.9%生理盐水配成1 mL CTX药液)，G1组予0.9%生理盐水1 mL单次腹腔注射。两组于腹腔注射造模后的第1、2、3、4、6、8周，断颈处死处于动情间期的大鼠各10只。

1.3观察指标 一般情况：每周观察大鼠体质量、精神、饮食、皮毛、排便及活动情况。动情周期：每天08：30取自制细棉签蘸取0.9%生理盐水后，轻轻在大鼠阴道内旋转1周，行阴道涂片，用95%乙醇固定5 min，在显微镜下观察细胞的种类和形态[2]。激素及细胞因子检测：腹主动脉取血，静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清置于-80 ℃保存待测。以双抗体夹心ELISA法测定大鼠血清中FSH、LH、E2、AMH、INHB水平，实验步骤严格按试剂盒操作。卵巢指数：完整取出大鼠双侧卵巢，去掉筋膜及脂肪组织，电子天平称质量，将称得的卵巢湿重分别除以体质量，卵巢指数=卵巢湿重(mg)/体质量(g)×100%。卵巢组织形态结构观察：称质量后左侧卵巢置于甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，行组织形态学观察。病理切片为连续5 μm切片，每间隔9张取1张切片(即第10张)，HE染色[1]。

2 结 果

2.1一般情况 两组大鼠观察期间全部存活。G1组大鼠外观体征、行为活动、精神状态、摄食、饮水、被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形状颜色等均正常。G2组大鼠给药后出现被毛疏松、活动减少、精神不振、四肢无力等，第6、8周可恢复正常。

2.2动情周期 G1组大鼠阴道涂片均有规则的动情周期变化，周期4～5 d，中位数4.5 d，动情间期1.5～2.5 d，中位数2 d。G2组大鼠在CTX 造模后第1、2、3、4 周阴道涂片显示动情周期发生改变，规则的动情周期变化消失，延长7～16 d，中位数11 d。阴道涂片显示分泌物少，有较多散在的白细胞，少量上皮细胞，部分有少量的角化细胞和有核细胞，动情间期5～7 d，中位数6 d。造模后第6周基本恢复正常的动情周期。

2.3卵巢指数 与G1组比较，G2组大鼠卵巢指数在造模后第1、2、3、4、6周明显降低(P<0.01)，第8周无差异(P>0.05)。G2组造模后第3、4、6周较第1周明显降低(P<0.05),第8周较第1周无明显变化(P>0.05)，见表1。

2.4卵巢组织 显微镜下G1组大鼠卵巢可清楚地分为皮质和髓质两部分，皮髓质结构清晰，各级卵泡及黄体的形态和结构均完整，间质腺少见，血管丰富，未发现间质炎症变化及纤维化等病变；髓质充盈，含有丰富的神经、淋巴管和较多的血管，未见充血、变性坏死等异常改变。G2组大鼠造模后从1周开始可见卵巢髓质部分萎缩，皮质明显增生且纤维化样变，颗粒细胞层数减少，排列疏松，甚至空泡，原始卵泡、成熟卵泡数减少，初级卵泡、次级卵泡、闭锁卵泡增加。血管壁增厚，玻璃样变，内膜纤维化，肌层增厚，部分血管腔狭窄甚至消失。从第4周开始，卵巢形态开始恢复，第8周卵巢形态部分恢复，原始卵泡减少，见图1。

2.5血清FSH、LH、E2、AMH、INHB水平 与G1组比较，G2组大鼠FSH在造模后第1、2、3、4、6、8周明显升高(P<0.01)；G2组大鼠造模后第4、6、8周与第1周比较明显降低(P<0.05)，见表2。与G1组比较，G2组大鼠LH在造模后第1、2、3、4、6周明显升高(P<0.01)，第8周无明显变化(P>0.05)，见表3。G2组大鼠E2在造模后第1、2、3、4、6、8周较G1组明显降低(P<0.01)；G2组大鼠造模后第4、6、8周与第1周比较明显升高(P<0.05)，见表4。与G1组比较，G2组大鼠血清AMH在造模后第1、2、3、4、6、8周明显降低(P<0.01)；G2组大鼠造模后第3、4、6、8周与第1周比较明显升高(P<0.05)，见表5。G2组大鼠INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周较G1组明显降低(P<0.01)；G2组大鼠造模后第6、8周与第1周比较明显升高(P<0.05)，见表6。

表1 两组大鼠卵巢指数的情况

A：G1组第1周；B：G2组第1周；C：G2组第2周；D：G2组第3周；E：G2组第4周；F：G2组第8周

图1 不同时间卵巢组织HE染色(×40)

表2 两组大鼠血清中FSH水平

表3 两组大鼠血清中LH水平

表4 两组大鼠血清中E2水平

表5 两组大鼠血清中AMH水平

表6 两组大鼠血清中INHB水平

3 讨 论

POI是女性在40岁之前卵巢衰退的临床综合征，以月经紊乱(如停经或稀发月经)伴有高促性腺激素和低雌激素为特征[3]，POI是DOR进一步发展的结果。DOR发病的危险因素包括晚生育(年龄大于35岁)、早绝经家族史、染色体异常、FMR1基因前突变携带者、患有卵巢损伤性疾病(如子宫内膜异位症、盆腔炎症等)或手术史、放化疗史、有吸烟嗜好等[4-5]。使用具有生殖毒性的化疗药物是引起DOR、POI、POF的一个明确病因。化疗制剂对卵巢功能的影响取决于它破坏细胞的速度和能力，最早损害的是生长卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞。一些化疗剂特别是烷基类可以通过损害DNA来杀伤细胞，甚至是不处于增殖状态的原始卵泡[5]。人体内 DNA修复基因随着年龄的增长而逐渐下调表达，化疗药物还可引起这些修复基因发生突变，明显增加化疗药物对卵泡的损伤作用而引起DOR[6]。

CTX是影响卵巢功能最大的化疗药物之一。它属于细胞周期非特异性药物，作用于细胞DNA而引起DNA单链或双链的断裂，导致DNA、RNA和蛋白质的合成受到抑制而使卵巢功能损伤。长时间使用高剂量CTX，容易引发永久性卵巢损伤，继而导致卵巢衰竭[7]。研究认为：CTX可破坏卵巢生长卵泡的颗粒细胞，使E2分泌减少，反馈引起FSH、LH升高[1]，另外CTX可使AMH、INHB表达降低，促进原始卵泡的“起始募集”，使原始卵泡向窦前卵泡发育，最终走向闭锁[8-9]。研究还表明，CTX能同时作用于原始卵泡的卵母细胞和前颗粒细胞，干扰卵泡的成熟，耗尽原始卵泡，使卵泡损伤[10]。

DOR属于POI、POF的前期状态，病情相对较轻，尽早治疗，卵巢功能尚有机会恢复正常。POF属于卵巢衰竭终末期，卵巢功能基本不能逆转。因此制造DOR动物模型要求大鼠卵巢功能有一定的损害，但又不能损害太严重。有学者[1]采用75 mg/kg CTX单次腹腔注射制造大鼠卵巢功能损害模型，发现用药后3 d、1周、2周卵巢功能均受到一定损害，原始卵泡数目减少，引起卵巢储备功能下降。CTX 75 mg/kg单次腹腔注射建立卵巢功能损害的大鼠模型成本低，手术操作简便，建模成功率高，但未对AMH、INHB、LH等指标进行检测。陈小平[11]复制了这一动物模型，发现用CTX 75 mg/kg单次腹腔注射造模后1、2、3、4周大鼠卵巢功能均受到一定损害,提示大鼠卵巢功能损害模型建模成功。但观察时间短，只进行了4周的研究，对于模型是否有自我恢复能力未做进一步观察。因此，结合前两个实验的优点与不足，设计了本实验。

本研究发现：在整个观察期间，两组造模大鼠无死亡，说明这种造模方法安全。CTX造模后1、2、3、4周动情周期延长7～16 d，动情间期延长5～7 d；卵巢组织中原始卵泡、成熟卵泡数减少，初级卵泡、次级卵泡、闭锁卵泡增加；卵巢指数在造模后第1、2、3、4、6周明显降低，FSH、LH在造模后第1、2、3、4、6周明显升高，E2、AMH、INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周明显降低。表明CTX 75 mg/kg单次腹腔注射用药建立卵巢功能损害的大鼠模型是成功的，与文献报道一致。

造模后2周AMH较造模后1周稍有升高，造模后3周E2较造模前2周稍有升高，造模后4周INHB较造模前3周稍有升高。造模后6周大鼠恢复规律的动情周期，卵巢组织形态恢复，但

原始卵泡数减少。造模后第8周卵巢指数较前6周稍有升高。说明CTX对卵巢储备功能损伤是肯定的，但模型有一定的自我修复能力，并未形成卵巢衰竭的状态，符合DOR的疾病发病特点。众所周知，卵巢功能一旦到了衰竭状态，治疗难度很大，目前尚未发现有药物能逆转已经衰竭的卵巢功能，但如果在疾病发生的早期就给予药物干预，卵巢功能衰竭的速度可减慢，甚至有逆转可能。

综上所述，采用75 mg/kg CTX单次腹腔注射能成功制造SD大鼠DOR模型。该法操作简便易行、造模时间短、成功率高，模型有一定的自我修复能力，值得推广应用。