香烟烟雾提取物对人颌骨来源成骨细胞矿化能力的影响

张志宏,李 钧,王 丁,庄润涛

(1北京民航总医院口腔科,北京 100123;2首都医科大学附属北京口腔医院;3北京交通大学社区卫生服务中心;*通讯作者,E-mail:15286928@qq.com)

由于较好的临床效果,牙种植体通常代替一个或多个缺失牙齿的最佳治疗方式[1,2]。与传统的修复治疗方案相比,牙种植体不仅具有较好的咬合功能,而且还具有更好的美学效果和较少的心理创伤[3,4]。尽管牙种植体已显示出高成功率,但也有研究报道在初始愈合期和维护期间偶有失败的案例[5]。一项长期研究的证据表明,牙种植体周围炎的发生率在11.2% -47.1%之间,如果不治疗,其中一些最终会种植失败[6]。植入物失败与病人的危险因素有关,如病人的全身状况、致病菌、植入物的宏观和微观设计、吸烟、骨质量、植入物的数量以及它们的分布[5,7,8]。有研究表明吸烟通常是牙种植失败的最常见因素之一[9],为评估吸烟与牙种植体的关系对人颌骨来源成骨细胞体外矿化能力的影响,本实验拟通过对比分析吸烟环境下的人颌骨来源的成骨细胞增殖、矿化能力及其相关基因表达的变化,来评估吸烟环境下对人颌骨来源成骨细胞体外矿化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

主要材料包括胎牛血清(杭州四季青公司,中国)、α-MEM培养基(Gibco公司,美国)、0.25%胰蛋白酶(Sigma公司,美国)、青链霉素(Gibco公司,美国)、葡萄糖(津北精细化工公司,中国)、MTT粉(Sigma公司,美国)、二甲基亚砜(Sigma公司,美国)、PBS缓冲液、4%多聚甲醛(北京化工试剂公司)、破膜工作液:CHAPS(Sigma公司)、超纯RNA提取试剂盒(CWbio公司)、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(CWbio公司)、UltraSYBR Mixture(With ROX)(CWbio公司)、DNase 1(CWbio公司)、5x RNA Loading Buffer(CWbio公司)。

1.2 实验试剂配制

①碱性磷酸酶孵育液：2%β-甘油磷酸钠2.5 ml，2%巴比妥钠2.5 ml，2%氯化钙4.5 ml，2%硫酸镁0.2 ml蒸馏水0.3 ml依次混合后，pH值调为9.2-9.4。②2%硝酸钴水溶液：硝酸钴2 g，蒸馏水加至100 ml。③1%硫化铵水溶液：硫化铵1 ml，蒸馏水99 ml。

1.3 成骨细胞来源

在首都医科大学附属北京口腔医院和民航总医院口腔科选择30位健康并进行牙种植的志愿者。所有骨屑样本分别取自患者在牙种植手术过程中产生的骨屑，取骨部位都在下颌磨牙区，骨质均为Ⅲ类。纳入标准：①年龄为30-50岁；②身体健康，无传染病、心脏病、吸烟、糖尿病等全身系统性疾病、无药物过敏史；③无其他不良生活方式，如酗酒，接受核辐射等；④同意并接受本次临床实验的患者。该研究已通过北京口腔医学伦理委员会审核。

1.4 实验方法

1.4.1 成骨细胞的分离、培养及传代 ①成骨细胞的分离：实验所需的成骨细胞来源于接受牙种植手术的健康人手术过程产生的骨屑，无菌条件下中分离出成骨细胞。②成骨细胞的培养：将种植手术过程中严格按照无菌原则取得的骨屑加入装有5 ml PBS的离心管中摇匀，以1 100 r/min分离心6 min，弃去上清，加入3 ml PBS摇匀后再次以1 100 r/min离心6 min，弃去上清。加入3 ml培养基，以小滴管吹打混匀，置于6 cm培养皿中，轻轻平摇培养皿以使骨屑分散，沉淀1 min后，吸出培养基，置于37 ℃孵育箱中15 min，取出后加入3 ml α-MEM培养基(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素100 mg/ml链霉素)，放入孵育箱中培养。约10 d左右待细胞自骨屑中爬出，更换培养基，之后依据细胞生长状况，每2 -3 d更换培养基，当成骨细胞汇合至80%时，PBS清洗两次，0.25%胰酶(pH=6.4)消化传代，相差倒置显微镜观察并照相。③成骨细胞的传代：当原代细胞汇合达80%时，PBS冲洗两次，用0.25%胰酶胰酶(pH=6.4)约2 ml消化1-2 min，加入等量的α-MEM培养基终止消化，反复吹打后将细胞悬液移入离心管，1 100 r/min,离心6 min，弃上清。加入α-MEM培养基(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)重悬细胞，1 ∶3的比例传代培养，待细胞再次汇合至80%时传代。

1.4.2 实验分组 本次研究分为三组进行以下实验,分别为低浓度香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)组、高浓度CSE组和健康对照组。CSE浓度制作见实验方法1.4.3。

1.4.3 CSE准备 每支过滤嘴香烟包含0.1 mg尼古丁和1 mg焦油(KENT香烟,韩国),被用来制备烟雾提取物。CSE在通风橱中通过将橡皮管连接的支架上的烟雾冒泡到蠕动泵来准备。通过橡胶管将泵流出道连接到浸没在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的玻璃吸管上。试验过程中10只香烟燃烧的烟雾刚好饱和溶解在20 ml的PBS中,我们设定为100%CSE。通过与将1 ml含有100%CSE的PBS溶液与199 ml的PBS溶液混合获得0.5%CSE的终浓度,与34 ml的PBS溶液混合获得3%CSE的终浓度。在MTT增殖测定中我们采用0.5%和3%的最终溶液浓度。阴性对照提取物采用未点燃的香烟制备。将提取物分成等分试样并-20 ℃储存。

1.4.4 成骨细胞的增殖能力检测 MTT法检测人颌骨来源成骨细胞的增殖能力,操作过程如下:将处于对数生长期的细胞接种于96孔板,待细胞贴壁后依实验组别不同分别给予不含有CSE、含有0.5%CSE及含有3%CSE的环境下培养。分别在培养后第1,3,5,7天,每孔各加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl并于37 ℃下孵育4 h。小心弃去培养液后每孔各加二甲基亚砜150 μl,混匀后在酶联检测仪上检测490 nm处吸光度值(OD值),绘制生长曲线。

1.4.5 成骨细胞的矿化能力检测 碱性磷酸酶染色法检测成骨细胞的矿化能力，操作过程如下：将细胞悬液滴入玻璃圆片的培养孔中，孵箱孵育培养。PBS冲洗及4%多聚甲醛室温固定30 min。用破膜液处理细胞15 min，PBS冲洗。加入碱性磷酸酶孵育液于37 ℃恒温箱孵育4-6 h，流水浸洗2 min，2%硝酸钴水溶液作用5 min，流水浸洗2 min，1%硫化铵水溶液处理30 s。最后流水浸洗数分钟，以甘油明胶封片拍照。

1.4.6 吸烟下的成骨细胞相关基因表达差异 为了进一步比较CSE对成骨细胞的体外矿化能力影响,从RNA水平鉴定成骨相关基因的表达,本研究选取ALP、COL-1和BSP基因进行检测。取细胞RNA并检测其质量,进行反转录,荧光定量PCR采用BIO-RAD CFX96序列检测系统来进行。设置扩增条件如下:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s共进行40个循环;最后72 ℃下延伸10 min。各待测样品分别以内参基因(GAPDH作为对照,同时设立阴性对照(不加模板),每个样品重复测3次,三次得到的Ct值结果平均值为最终测定结果。引物由南京凯基生物工程有限公司合成,引物序列见表1。

表1 目的基因的引物序列

2 结果

2.1 吸烟环境下对人颌骨来源成骨细胞增殖能力的影响

MTT检测结果显示，高CSE组的成骨细胞增殖能力与低CSE组和对照组比较明显降低。三组细胞都是从接种的第3天开始进入对数生长期,第4-7天时均处于增殖旺盛期,从接种的第3天开始,一直到检测的第7天,高CSE组颌骨来源成骨细胞的增殖能力均低于对照组和低CSE组(见图1)。

图1 MTT检测三组成骨细胞的增殖Figure 1 Proliferation of osteoblasts in three groups by MTT

2.2 吸烟环境下对人颌骨来源成骨细胞矿化能力的影响

低CSE组与对照组相比碱性磷酸酶染色水平差异不明显,这说明低CSE组与对照组的成骨细胞矿化能力差异不明显;而与对照组相比,高CSE组的碱性磷酸酶水平明显降低(见图2)。

2.3 吸烟环境下对人颌骨来源成骨细胞相关基因表达

根据前面的结果已经明确:一定浓度以上的CSE能够影响人颌骨来源成骨细胞的增殖与矿化,那么它是怎样影响这些过程的,是否对成骨细胞增殖与矿化的相关基因产生了影响。为解决这个问题,我们通过RT-PCR检测了相关基因的表达。选取ALP、COL-1和BSP基因进行分析,以GAPDH作为内参进行实验,用2-ΔΔCt法进行分析,检测不同组中基因相对表达量的变化,结果见图3。高CSE组与对照组的ALP、COL-1和BSP基因的相对表达量无明显差异。而低CSE组人颌骨来源成骨细胞的ALP、COL-1和BSP基因表达低于对照组与高CSE组。

图2 不同CSE浓度下碱性磷酸酶染色Figure 2 Alkaline phosphatase staining of human jawbone-derived osteoblasts after treated with different concentrations of CSE

与对照组和低CSE组比较，*P<0.05图3 矿化基因在三组的相对基因表达量Figure 3 Expression of ALP，COL-1，and BSP in three groups

3 讨论

香烟通常含有大约1.2-2 mg尼古丁,这取决于香烟的品牌以及是否存在过滤嘴。尼古丁是香烟烟雾的主要成分,吸烟已被证实与骨代谢和骨骼重塑的负面影响有关[10]。但是,尼古丁对培养的成骨细胞的影响仍有争议,主要存在低剂量刺激效应和高剂量负效应的双相效应[11-13]。在一项使用MG-63人类成骨样细胞系的研究中,Rothem等[14]证实了暴露于100 μm尼古丁的细胞中842个基因的统计学显著性变化,并检测了低剂量尼古丁诱导的OC、I型胶原和ALP上调表达。另一项研究检测了尼古丁对兔骨髓衍生的成骨样细胞的成骨细胞活性的剂量依赖性正效应,并且表明尼古丁可能不是造成吸烟者中观察到的骨愈合受损的原因[15]。同一组的先前研究也表明通过经皮尼古丁贴片递送的尼古丁显著增强了兔子的后部脊柱融合率[16]。

尽管尼古丁是所有香烟烟雾颗粒相的主要成分,并且通过习惯性吸烟维持在身体组织中,但吸烟暴露与尼古丁暴露对骨骼的影响可能不同。Skott等[17]研究了尼古丁和不含尼古丁的烟草提取物单独或联合应用对大鼠股骨骨折模型中股骨闭合性骨折的机械强度的影响。当机械测试骨折愈合时,与烟碱组相比,烟草提取物组屈服点的极限扭矩和扭矩分别下降20%和26%。另外,与尼古丁组相比,在联合组中观察到屈服点扭矩减少18%。然而,在烟草提取物和联合组之间没有发现差异。另一项研究报道尼古丁可以作为骨细胞代谢活动的直接兴奋剂,烟雾凝聚物(含有相当水平的尼古丁)在小鼠MC3T3-E1成骨细胞样细胞中引起抑制作用[18]。这些结果表明吸烟,而不是只是暴露于尼古丁,可能是主要因素。

在本研究中,当暴露于浓度等于0.5%的CSE时,成骨细胞的存活力降低。我们同时也观察到0.5%浓度的CSE对降低人颌骨来源成骨细胞的ALP、COL-1和BSP基因表达,降低成骨细胞的活性和矿化。