一种基于丝裂霉素诱导的人脂肪干细胞衰老模型

张明萌,饶敏腊,刘亭亭,陈艺琳,赵 威,廖小欣,李晓毅,彭健愉,刘新光,5,孙雪荣*

(1广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室,衰老研究所,东莞 523808;2广东医科大学药学院;3广东医科大学第二临床学院;4广东医科大学医学检验学院;5广东医科大学生物化学与分子生物学研究所;*通讯作者,E-mail:xuerongsun@126.com)

脂肪干细胞(ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的间充质干细胞,具有自我更新和向脂肪、骨骼、软骨、肌肉等多向分化的潜能[1,2]。在机体衰老过程中,体内干细胞也会出现衰老、凋亡和数量减少,并最终导致机体功能受损[3]。

细胞衰老是指细胞周期的永久停滞,并常伴随体积增大,衰老染色阳性及功能失调等变化[4],是细胞常见的生物学功能之一。衰老的发生机制常与持续的DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)有关,同时伴随细胞分泌功能增加,即所谓的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[5]。SASP因子种类复杂多样,主要包括趋化因子、生长因子、促炎因子等。这些因子可以根据所处环境的不同对机体产生正面或负面影响,例如促进组织修复、抑制肿瘤发展或导致机体慢性炎症及衰老相关疾病的发生[6]。

建立简单有效的细胞衰老模型,将有利于衰老机制及抗衰老研究。文献报道,多种抗癌药物能够通过诱导DNA损伤,导致细胞衰老[7]。丝裂霉素(mitomycin,MMC)是一种从放线菌培养液中分离出的抗肿瘤药物,可抑制DNA和RNA的合成,而诱导细胞凋亡[8]。MMC也可以导致细胞DNA损伤和氧化应激[9,10]。我们前期研究发现,MMC可以诱导小鼠NIH-3T3细胞出现典型的衰老表型,并伴随SASP的发生[11]。鉴于此,本研究拟用MMC诱导ADSCs衰老,并检测衰老相关指标,以期建立一种简单有效的ADSCs衰老模型。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和处理

ADSCs细胞由本实验室保存。本研究选用P6代ADSCs,复苏后用低糖DMEM培养基(Gibco公司),含2%B27(Gibco公司)和10%胎牛血清(FBS,Hyclone公司),于5%CO2、37 ℃细胞培养箱进行培养,每3 d更换一次培养基。当细胞长到80%-90%融合时,用胰蛋白酶(Gibco公司)进行常规消化并传代。用PBS将MMC(浙江海正药业股份有限公司)配制成1 mg/ml的储存液,避光保存。

1.2 β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色检测细胞衰老表型

分别用0.5 μg/ml,1 μg/ml和3 μg/ml的MMC处理ADSCs,每组设三个复孔,24 h后撤去MMC更换为新鲜生长液,并继续培养到7 d,与正常培养的ADSCs同时进行β-gal染色。根据β-gal染色试剂盒说明书(Beyotime公司),将细胞用PBS洗涤3次,加β-gal染色固定液,室温固定15 min,吸出细胞固定液后再用PBS洗涤三次。加入提前配好的染色工作液(A液:1%;B液:1%;C液:93%;X-gal溶液:5% ),37 ℃避光孵育过夜。24 h后于显微镜下观察并拍照。随机选取5个视野,计数蓝染细胞并计算百分率。

1.3 高通量RNA芯片筛选衰老ADSCs的差异表达基因

将正常培养的ADSCs和0.5 μg/ml MMC处理的ADSCs分别提取细胞RNA进行芯片检测。采用Agilent Feature Extraction软件分析芯片图像文件,利用GeneSpring V13.0软件(Agilent)对数据进行归一化校正处理分析。选取差异基因表达倍数变化2倍以上,t检验P<0.05的基因进行进一步分析。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测差异表达的衰老相关基因表达量

根据说明书,用TRIzol®(Life公司)分别提取正常培养和0.5 μg/ml MMC处理的细胞总RNA,并检测RNA浓度及纯度。用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa公司)反转录合成cDNA,并以其为模版进行扩增。使用SYBRTMSelect Master Mix试剂盒(Applied Biosystems公司)在LightCycler®96实时定量PCR仪(Roche公司)中进行PCR反应,反应体系为10 μl,其中SYBR Green qRCR混合液5 μl,上下游引物各0.5 μl,灭菌水3.25 μl,cDNA模板0.75 μl。以GAPDH作为内参基因。引物序列见表1。

1.5 样品制备和ELISA检测衰老相关蛋白的分泌

ADSCs用MMC处理24 h后更换正常培养液,继续培养7 d后收集上清液,底层细胞进行计数。将收集的上清液在低温下离心,除去沉淀,进行ELISA检测。ELISA检测方法参照武汉博士德生物工程有限公司提供的IL-8(EK0413)和IL-1α(EK0389)ELISA试剂盒的说明书。最后在450 nm波长处检测吸光度,并根据标准曲线计算样本的浓度。

表1 本研究涉及的引物序列

1.6 Western印迹分析检测p21和γ·H2AX的表达

将收集的蛋白以每孔15 μl加入到提前制好的蛋白胶孔中,经SDS-PAGE分离胶进行电泳分离,随后在250 mA、1.5 h的湿转条件下将蛋白转移至PVDF膜(Millipore公司)上,用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h后分别与p21(1 ∶2 000稀释)抗体和γ·H2AX(1 ∶1 000稀释)抗体进行杂交,4 ℃孵育过夜。次日用TBST漂洗3次后与辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000稀释)进行杂交,室温孵育1 h后用TBST漂洗3次。接着,使用ECL发光液(Thermo公司),使用可见荧光免疫印迹成像系统仪Azure c400成像系统(Azure Biosystems公司)对蛋白表达水平进行检测。

Tubulin抗体作为内参,购自Invitrogen公司(A11126),p21抗体(#2946)和γ·H2AX抗体(#2577)购自Cell Signaling Technology公司。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 MMC诱导ADSCs出现衰老表型

为了研究MMC是否可以诱导ADSCs衰老,我们分别用三种不同浓度的MMC处理ADSCs,24 h后撤去MMC更换为新鲜生长液,并继续培养到7 d进行β-gal染色。结果显示,MMC处理后7 d,ADSCs体积呈不同程度增大,增殖明显减慢,同时β-gal染色阳性细胞显著增多(见图1A)。三种浓度MMC均可诱导类似的表型改变,0.5 μg/ml和1 μg/ml MMC处理组ADSCs蓝染细胞百分率分别为80.8%和82.5%,3 μg/ml MMC组细胞蓝染率略低,约为70.2%,均显著高于对照组(P<0.01,见图1B)。因此,我们选取0.5 μg/ml MMC进行后续实验。

图1 MMC处理诱导ADSCs出现细胞衰老表型Figure 1 MMC induced a senescent phenotype in ADSCs

2.2 高通量RNA芯片筛选衰老ADSCs的差异表达基因

为了探究衰老ADSCs的差异表达基因,我们将正常培养和MMC诱导衰老的ADSCs分别进行芯片检测,并对差异基因进行聚类分析。散点图显示,经MMC处理后,衰老ADSCs表达上调的基因有691个,下调的基因有589个(见图2)。差异基因通路富集分析发现,变化最显著的前3个通路分别为细胞周期、有丝分裂及分裂M期,提示细胞发生了周期阻滞,同时DNA甲基化相关基因也有富集(见图3)。特别值得注意的是,与炎症相关的SASP基因也有明显富集,提示衰老ADSCs伴随着分泌功能的改变。

图2 MMC处理前后ADSCs差异表达基因的散点图Figure 2 Scatter plot of differential gene expression in ADSCs before and after MMC treatement

图3 MMC处理前后ADSCs差异表达基因的通路富集Figure 3 Pathway enrichment of differential gene expression in ADSCs before and after MMC treatment

2.3 衰老ADSCs表达SASP及其他衰老相关基因的检测

为进一步了解衰老ADSCs的基因表达特征,我们检测了常见的SASP基因(IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β和TNF-α)及其他衰老相关基因(p16,p21,p53)的表达情况。定量RT-PCR结果显示,相比对照组ADSCs,衰老ADSCs表达SASP基因IL-1α和IL-1β显著增高(P<0.05);IL-6和IL-8也是常见的SASP基因,其表达亦明显上调,但差异无统计学意义(P>0.05),而TNF-α有轻度降低,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞衰老相关基因p16,p21,p53在mRNA水平均无明显变化(见图4A)。

为了检测上述基因在蛋白水平的变化,我们分别收集两组ADSCs培养上清液,并用ELISA检测IL-8及IL-1α的分泌水平。结果显示,衰老ADSCs分泌IL-8及IL-1α均有一定增强,但差异无统计学意义(P>0.05,见图4B)。我们用H2O2处理的ADSCs作为阳性对照,Western blot检测发现,MMC诱导的ADSCs表达γ·H2AX和P21蛋白明显上调(Tubulin作为内参)(见图4C),表示发生了DNA双链断裂和细胞周期阻滞,从而导致细胞衰老的发生。

与对照组相比,*P<0.05图4 MMC处理后的脂肪干细胞表达SASP及衰老相关基因的变化Figure 4 Expression of SASP and senescence-related genes in senescent ADSCs after treatment with MMC

3 讨论

ADSCs在体内和体外均可发生细胞衰老。衰老ADSCs会出现一系列改变,包括分化潜能的改变及生理功能失调,从而引起机体代谢失调或疾病[12]。因此,建立简单易行的ADSCs衰老细胞模型,深入研究ADSCs发生衰老的机制,可为延缓ADSCs衰老奠定基础。

SASP是衰老细胞常见的特征,衰老细胞通过分泌多种SASP因子,对局部或全身产生调节作用。SASP产生的机制主要包括持续的DDR[13],p38MAPK的激活[14],NF-κB通路的激活[15]等。IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β、TNF-α均属于SASP中的促炎细胞因子,其中IL-6、IL-8表达最为普遍[16],IL-1α既属于SASP的重要成员,同时也可以调节其他SASP因子的表达[17]。细胞衰老通常伴随p53/p21或p16/Rb通路的激活,p16、p21是衰老中细胞周期停滞的主要驱动因子,通常被视为衰老的特异性标记[18,19]。

MMC作为一种抗肿瘤药物,可以引起细胞发生化疗诱导的衰老[7]。本研究发现,MMC可通过诱导DNA损伤,上调p53/p21通路,而促进ADSCs衰老。衰老ADSCs表现为细胞体积增大,β-gal染色阳性,细胞周期阻滞,并出现细胞周期及DNA甲基化基因等变化。同时,衰老ADSCs具有一定的SASP现象,表现为IL-1α和IL-1β表达升高,但相对我们前期研究的黑色素瘤细胞,SASP相对较弱[20]。在蛋白水平IL-1α升高不显著,可能是由于实验重复次数尚不足。本研究中,我们发现,在mRNA水平,衰老ADSCs细胞p21mRNA无显著变化,但蛋白水平有明显上升,提示MMC处理后,P21蛋白稳定性增强。

总之,本研究建立了一种简单有效的ADSCs衰老模型,可在一周左右造成细胞衰老。该模型具有较典型的衰老表型,稳定性较好,可作为后续研究ADSCs衰老机制的基础,为筛选抗衰老药物等提供便利。