青钱柳叶提取物对Caco-2细胞二糖酶活性的抑制作用

王丽玲，柏明娥，刘本同，王衍彬，徐高福



青钱柳叶提取物对Caco-2细胞二糖酶活性的抑制作用

王丽玲1，柏明娥1，刘本同1，王衍彬1，徐高福2

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省淳安县新安江开发总公司，浙江 淳安 311700）

采用Caco-2细胞模型，分析了青钱柳叶水提物、醇提后的水提物、95%醇提物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物5种不同提取物对Caco-2细胞活力的影响及对Caco-2细胞上麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶3种二糖酶活性的抑制作用。结果表明，5种不同提取物中除95%醇提物对Caco-2细胞活力产生一定影响外，其余4种提取物对Caco-2细胞基本无毒性，在200 mg·L-1浓度提取物范围内培养24 ~ 72 h后细胞仍能保持较高活力；对3种二糖酶活性抑制作用效果最好的为醇提后的水提物，尤其是对蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更为明显，最高的抑制率分别达到76.35%和60.13%，其次为乙酸乙酯萃取物，对乳糖酶的抑制率最高达54.41%。从青钱柳叶不同方法提取物的制备流程说明多糖类或中等极性的黄酮甙类有可能是青钱柳叶中抑制二糖酶活性的主要组成成分。

青钱柳；Caco-2细胞；二糖酶活性；麦芽糖酶；蔗糖酶；乳糖酶

随着经济的发展和人们生活水平的提高，高血压、高血脂、高血糖即“三高”人群的数量也在逐年增加，严重威胁人类的身体健康。特别是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）已成为继心脑血管、肿瘤之后的重大非传染性流行病的第三大杀手。据统计，2011年全球糖尿病患者已达3.7亿人，预计到2030年将达5.5亿人[1]。由于引起糖尿病的病因十分复杂，治愈难度大，糖尿病患者往往需要长期或终身服用药物来控制病情，但目前临床上使用的化学药物若长久服用会产生如肝脏损害、严重低血糖、过敏性休克等副作用[2]。因此，研究目标逐渐转移到一些降糖植物上，从植物中开发毒副作用小的新型降糖药。众多临床实践和大量研究也表明从植物中得到的一些提取物可以明显改善糖、脂代谢，在治疗糖尿病及其并发症中发挥着独特的作用[3-6]。

青钱柳系胡桃科Juglandaceae青钱柳属植物，为我国特有，是冰川世纪幸存下来的珍贵树种[7]。民间常取其叶作代茶饮，具有清热解毒、防病治病等功效[8]。目前国内外对青钱柳的化学成分和药理作用的研究已取得很大进展，研究表明青钱柳中含有丰富的天然药用成分，其结构类型主要有多糖、黄酮、酚类、萜类、皂苷、有机酸、微量元素等[9-15]，许多研究证实青钱柳具有明显的降血糖[16-17]、降血压[18]、降血脂[19-20]、抗氧化[21-22]、抗肿瘤[23-24]和增强机体免疫功能[25-26]等作用。特别是在糖尿病防治方面功效显著，已有研究表明青钱柳中的多糖、黄酮、微量元素等化学成分都具有良好的降血糖作用[27-29]。

糖类是人体所需的主要能量来源之一，食物中的淀粉等多糖均需在消化道内先分解为二糖，再经存在于小肠黏膜刷状边缘处的二糖酶（蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶等）等作用分解为单糖后，才能被小肠上皮细胞吸收进入血液循环[30]。人体对碳水化合物的利用吸收依赖于这些酶的活性，当这些酶的活性被抑制后，就可以延缓葡萄糖在肠道的吸收，从而起到控制并有效地降低血糖的作用[31]。有研究表明青钱柳黄酮和青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶有很强的抑制活性，能和酶迅速结合并抑制其活性，从而降低糖尿病小鼠的空腹血糖[32-34]。为了进一步研究青钱柳降血糖的作用机制及活性组分的筛选，本试验采用Caco-2细胞模型，分析青钱柳叶的不同提取物对麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶3种二糖酶活性的抑制效果，以期为青钱柳叶的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

供试青钱柳叶采自浙江省遂昌县王村口镇山井村，119°04′53″ E，28°20′49″ N，海拔1 059 m，系人工种植5年生苗。采集时间为2016年9月底，每片复叶除叶片顶端保留2 ~ 3片小叶外其余叶片全部摘取，所采鲜叶经自然干燥后经100℃高温处理3 ~ 5 min，冷却后装于塑料袋内保存，实验前用粉碎机粉碎至80目备用。

Caco-2细胞ATCC#HTB-37购自于American Type Culture Collection，ATCC；胎牛血清SH30070.03（Fetal Bovine Serum，FBS）、DMEM培养基SH30243.01B（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、青霉素（Penicillin）/链霉素（Streptomycin）双抗SV30010、磷酸盐缓冲液SH30256.01（Phosphate Buffered Salin，PBS）、胰蛋白酶SH30042.01B均购自美国Hyclone公司；葡萄糖测定试剂盒购自北京索莱宝科技股份有限公司；BCA法蛋白定量试剂盒、MTT检测试剂盒均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）购自国药集团化学试剂有限公司；乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等试剂均为国产分析纯，购自杭州汇普化工仪器有限公司。

其它仪器还有酶标仪（Thermo Scientific，USA），二氧化碳培养箱（日本三洋SANYO公司），冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），恒温振荡培养箱（太仓华美生化仪器有限公司），真空冷冻干燥机（美国Labconco公司，FreeZone 2.5升），RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），DLSB-1005低温冷却液循环泵（杭州大卫科教仪器有限公司），HH-ZK1数显式电热恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司），移液枪、细胞培养瓶、96孔细胞培养板（Thermo Scientific，USA）。

1.2 试验方法

1.2.1 青钱柳叶提取物的制备

1号样品：称取100 g备用青钱柳粉，加8 ~ 10倍的蒸馏水于90℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并滤液后减压浓缩，最后冷冻干燥得青钱柳叶水提取物。

2号样品：称取1 000 g备用青钱柳粉，加10倍95%乙醇于80℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并滤液后减压浓缩至膏状，取约一半膏状物挥干溶剂后进行冷冻干燥得青钱柳叶95%乙醇提取物；

3号样品：将上述经醇提后的药渣晾干后，取100 g加8 ~ 10倍蒸馏水90℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并滤液后减压浓缩，最后冷冻干燥得青钱柳叶醇提后的水提物；

4号样品：用上述95%乙醇提取物浓缩至膏状的剩余样品，加适量蒸馏水混匀经石油醚萃取后，用乙酸乙酯萃取3 ~ 4次，合并萃取物，减压浓缩，挥干溶剂后进行冷冻干燥，得青钱柳叶乙酸乙酯萃取物；

5号样品：将上述经乙酸乙酯萃取后的剩余物再用正丁醇萃取3 ~ 4次，合并萃取物，减压浓缩，挥干溶剂后进行冷冻干燥，得青钱柳叶正丁醇萃取物。

青钱柳叶不同提取物的制备流程见图1。

图1 青钱柳叶不同提取物的制备流程

Figure 1 Preparation of different extracts fromleaves

1.2.2 细胞培养 Caco-2细胞株在37℃，5% CO2浓度条件下在培养箱内进行培养，DMEM培养基，内含10%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素，在T25细胞培养瓶中培养。细胞培养3 d后即可生长至80% ~ 90%瓶底面积，然后使用含EDTA胰酶进行消化，按照1:3或1:5的比例传代。

1.2.3 青钱柳叶提取物对Caco-2细胞的毒性试验 采用MTT法检测青钱柳叶5种提取物在200 mg·mL-1浓度范围内对Caco-2细胞毒性的影响。收集培养的对数生长期Caco-2细胞，制成单细胞悬液，以每孔103~ 104个细胞数接种到96孔板（每孔体积200 μL）；将上述青钱柳叶提取物样品按照200，100，50，25 mg·L-1（DMSO溶解）终浓度加入孔中，对照（CK）组加入DMSO，于37℃，5% CO2培养箱培养24 h，48 h，72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg·mL-1用PBS 配）20 μL，继续孵育4 h；终止培养后小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，于570 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值，根据各吸光度值计算出细胞活力，计算公式如下：

细胞活力（%）=（1－0））/（2－0）×100

式中，1为样品组的吸光度，2为对照组的吸光度，0为空白。

1.2.4 青钱柳叶提取物对Caco-2细胞二糖酶活性的抑制试验 取对数生长期的细胞，以每孔103~ 104个细胞数量接种到96孔板内继续培养至形成致密单层（约15 ~ 21 d）后，吸去上清液，用PBS缓冲液冲洗3次，除去细胞表面附着物。试验分CK组和样品组，CK组每孔加入0.7 mL PBS缓冲液；样品组每孔加入0.5 mL含28 mmol∙L-1的麦芽糖/蔗糖/乳糖PBS缓冲液和0.2 mL样品溶液，使各样品的终浓度为200，100，50，25 mg·L-1，于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养40 min，并充分震荡，立即冰浴结束反应，利用葡萄糖测定试剂盒测定上清液中葡萄糖含量。收集细胞并提取总蛋白，用BCA蛋白质定量试剂盒测定总蛋白含量，按下式计算二糖酶活性：

二糖酶活性=（反应后葡萄糖含量－反应前葡萄糖含量）/180.2×总蛋白含量×反应时间

各样品对二糖酶活性的抑制率：抑制率（%）=（二糖酶活性对照组－二糖酶活性样品组）/二糖酶活性对照组×100

1.3 数据处理

各组试验均重复3次，取平均值，试验数据采用Excel表进行绘图和SPSS 17.0软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取物对Caco-2细胞活力的影响

青钱柳叶不同提取物不同浓度培养Caco-2细胞24 h，48 h，72 h后细胞活力试验结果见图2。

注：* ， # ，& 分别表示24 h，48 h，72 h处理下各浓度样品与CK间有极显著性差异（P<0.01）。

Figure 2 Effect of different concentration of extracts on cell viability

从图2可以看出，1号样品细胞活力较高的为25 mg·L-1浓度培养72 h，48 h，分别达到123.07%和103.32%（图2A），极显著大于CK（<0.01），说明低浓度下1号样品对细胞生长不但没有毒性，反而具有促进作用，其它培养条件下细胞活力虽小于CK，但大部分都在65%以上，说明1号样品在所试验的浓度段内对细胞活力的影响较小；2号样品在不同浓度和不同时间处理下其细胞活力均极显著低于CK（<0.01）（图2B），除25，50，100 mg·L-1浓度下培养72 h其细胞活力大于50%外，其余均在50%以下，说明2号样品对Caco-2细胞活力的影响相对较大；3号样品在试验范围内细胞活力均达到50%以上（图2C），最高的为25，50 mg·L-1浓度下培养48 h，细胞活力达到121.05%和120.47%，极显著大于CK（<0.01）；4号样品（图2D）和5号（图2E）样品与3号样品相似，除了高浓度下培养72 h时间其细胞活力稍低外，其余均达到80%以上，有的甚至大于CK，说明4号、5号样品和3号样品一样对细胞基本无毒性。综上所述，5种样品中除2号样品对细胞活力有一定影响外，其余4种样品在试验浓度范围内（≤200 mg·L-1）对Caco-2细胞活力无明显抑制作用，基本无毒性。

2.2 不同提取物对Caco-2细胞二糖酶活性的抑制作用

青钱柳叶不同提取物对Caco-2细胞3种二糖酶的抑制作用试验结果见表1。

表1 青钱柳叶提取物不同浓度对二糖酶活性的抑制率

从表1可以看出，1号样品对3种二糖酶活性的抑制作用仅在低浓度25 mg·L-1处理下才有所体现，抑制作用最好的为乳糖酶，抑制率为22.79%，其次为麦芽糖酶，抑制率为9.98%；2号样品对3种二糖酶活性的抑制作用均不明显，最高的也仅为4.56%，这可能与上面试验结果中的2号样品对细胞活力有一定影响有关；对3种二糖酶活性抑制作用效果最好的为3号样品，对蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更为明显，最高的为25 mg·L-1浓度处理，分别达到76.35%和60.13%，且随浓度的增大抑制率逐渐降低，而对麦芽糖酶抑制率最高（21.65%）的为100 mg·L-1浓度处理，在其它浓度处理下也表现出不同程度的抑制作用；4号样品对乳糖酶的抑制作用好于麦芽糖酶和蔗糖酶，抑制作用最好的为100 mg·L-1浓度处理，抑制率为54.41%；5号样品在100 mg·L-1浓度处理下对乳糖酶的抑制作用表现最好，抑制率为42.51%，而对其它2种二糖酶活性的抑制作用仅在低浓度条件下才有所体现，在高浓度条件下则无抑制作用。

3 结论与讨论

本实验利用Caco-2细胞模型，模拟小肠吸收葡萄糖，研究了青钱柳叶的不同提取物对3种二糖酶的抑制作用。试验结果表明，5种提取物中除2号样品（95%醇提物）对Caco-2细胞具有一定毒性，影响其细胞活力外，其余4种样品对细胞基本无毒性，在200 mg·L-1浓度范围内培养24 ~ 72 h后细胞仍能保持较高的活力；对3种二糖酶活性抑制作用效果最好的为3号样品，尤其是对蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更为明显，最高抑制率分别达到76.35%和60.13%，其次为4号样品，对乳糖酶的抑制率最高达54.41%。

药用植物中，具备抗α-葡萄糖苷酶活性的有效成分主要由多酚、黄酮及黄酮苷、生物碱、三萜及其苷类、肽类、酯类、酸类等组成[35]。由于天然产物的组成成分及结构相当复杂，系统分离法的目的是按照相似相容原理，利用溶剂极性大小对有机成分进行分类提取，得到成分相似的不同组分，再分别进行药效试验，确定该部分是否有效，找出关键成分。水作为强极性溶剂常用于提取极性很大的甙类、糖类、氨基酸、蛋白质、小分子有机酸等；乙醇作为亲水性有机溶剂，除了蛋白质、粘液、果胶、淀粉和部分多糖外，其它极性成分大部分都能溶解；乙酸乙酯和正丁醇作为中等和中等偏大极性的有机溶剂常用于提取中等极性的黄酮甙类和中等偏大极性的某些甙类（如皂甙、蒽酮甙等）。试验分析表明，3号样品为青钱柳叶经95%乙醇提取后的水提物，对二糖酶活性的抑制作用效果明显好于1号样品（直接水提），其次为4号样品和5号样品（乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物），说明多糖类或中等极性的黄酮甙类有可能是青钱柳叶中抑制二糖酶活性的主要组成成分，多糖对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的研究由来已久，早在2010年，张小芳等[36]也发现青钱柳粗多糖具有降血糖作用并对胰岛组织有一定的保护作用。近年来，王小江等[37]发现青钱柳多糖CP50具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而对于黄酮类成分，最新研究表明青钱柳总黄酮联合多糖具有较好的的降血糖作用，并能改善糖尿病大鼠的肝肾功能和胰岛素水平，联合用药效果优于其单一用药[38]。这些研究与本文采用的Caco-2细胞体外模拟小肠环境研究得出的结论是一致的。中等极性的黄酮类成分和水溶性多糖可能是青钱柳降血糖作用的物质基础，而其确切的有效成分及作用机制还有待进一步研究。

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Inhibition Effect of Extracts fromLeaf on Activity of Disaccharide in Caco-2 cells

WANG Li-ling1，BAI Ming-e1，LIU Ben-tong1，WANG Yan-bin1，XU Gao-fu2

（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Chun’an Xin’anjiang Development Corporation of Zhejiang, Chun’an 311700, China）

Collection was carried out of leaves of 5-yearplanted in Suichang, Zhejiang province by the end of September 2016. Experiments were implemented on effect of water extract, water extract after alcohol extraction, 95% alcohol extract, ethyl acetate extract and n-butyl alcohol extract from leaves ofon cell activity of caco-2 cells and inhibitory effects on activity of maltase, sucrose and lactase. The results showed that 95% alcohol extract had impact on the activity of caco-2 cells and the other four extracts had non-toxic to caco-2 cells. Water extract after alcohol extraction had the best inhibitory effect on the activity of disaccharide, especially on that of sucrose and lactase, with the highest inhibition rate of 76.35% and 60.13%, followed by ethyl acetate extract, with the highest inhibition rate of lactase of 54.41%.

; caco-2 cells; activity of disaccharides; maltase; sucrase; lactase

10.3969/j.issn.1001-3776.2019.01.005

S792；R285.5

A

1001-3776（2019）01-0028-07

2018-09-10；

2018-12-09

浙江省省属科研院所扶持专项“叶用青钱柳定向培育技术研究与产品开发”（2017F30019）

王丽玲，副研究员，从事天然活性成分功能研究；E-mail:echo22239@163.com。

柏明娥，研究员，从事资源植物开发；E-mail:baiminge66@163.com。