高温胁迫对月季生理特性和叶绿素荧光参数的影响

张方静，罗 峰，谭殷殷，张旻桓，邢 文，金晓玲,2

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南省环境资源植物开发与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

月季(RosachinensisJacq)为蔷薇科蔷薇属植物，半常绿低矮灌木，四季开花，故又称长春花、斗雪红、四季花等，是我国传统十大名花之一，在园林和花卉市场上占有非常重要的地位。月季生长最适温度为15～26 ℃，30 ℃以上的高温会导致月季花芽停止分化，无法正常开花，同时还会导致白粉病、黑斑病等病害产生，严重影响其观赏价值。因此，了解月季耐热性机制成为研究重点。目前,关于月季耐热性研究主要集中在生理方面,游离脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、叶绿素(Chl)含量、丙二醛(MDA)含量、相对电导率(Rec)、可溶性蛋白(SP)含量均与月季耐热性有关[1-2]。近年来，众多研究表明,叶绿素荧光分析技术能够反映高温对植物的伤害，是筛选植物耐高温品种的重要技术手段，被广泛应用于植物耐热性研究[3-5]。关于叶绿素荧光在月季抗逆性研究中的应用，主要体现在利用叶绿素荧光来评价月季的耐弱光性，以及土壤水分胁迫下月季的光合特性等[6-7]。月月红和月月粉是最初被引种至欧洲参与品种培育的中国种源之一，大部分鲜切花都是由这2种月季作为父母本杂交而来[8]，对于月季的育种有着重要的意义。关于这2种月季对高温的生理响应和叶绿素荧光特性尚未见报道。鉴于此，以月月红和月月粉为试材，研究高温胁迫对2种月季生理指标和叶绿素荧光特性的影响，并结合主成分分析及隶属函数综合评价其耐热性，为研究月季耐热性机制提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

材料为月月红和月月粉的2年生扦插苗。

1.2 试验方法

试验于2018年3月在中南林业科技大学园林植物实验室中进行。选取生长健壮、长势一致的月月红、月月粉盆栽苗，培养基质配方为V(泥炭土)∶V(椰糠)∶V(蛭石)=3∶1∶1，高温处理前把植株放入人工气候箱(25 ℃)中培养7 d，随后进行高温处理，温度分别为25、30、35、40、45、50 ℃，连续高温诱导8 h，利用电导率仪测定2种月季在不同处理温度下的电导率，根据Logistic方程，计算半致死温度(LT50)。

根据LT50设置胁迫温度为45 ℃，胁迫时间为0、2、6、12、24 h，以0 h为对照。处理过程中空气相对湿度为80%，光照强度为5 000 lx。处理时间过后，立即取高温处理不同时间段的叶片，测量Rec、Chl含量、叶绿素荧光参数，剩余叶片用液氮速冻后放入超低温冰箱(-80 ℃)保存，以备测定其余生理指标。每棵植株上选取3片叶进行测量。

1.3 测定指标与方法

Rec采用电导仪测定法，Chl含量采用丙酮、乙醇混合液提取法，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法，SS含量采用蒽酮比色法，SP含量采用考马斯亮蓝染色法，Pro含量采用茚三酮显色法，SOD活性采用NBT法[9]。

采用LI-6400型便携式光合仪(Li-Cor,Lincoln,美国)测定叶绿素荧光参数[10]：光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(qN)、最大荧光产量(Fm)、光合电子传递速率(ETR)、有效光化学量子产量(Fv′/Fm′)、固定荧光(Fo)。所有指标测定均重复3次。

1.4 数据处理及分析

(1)运用隶属函数法计算2种月季的隶属函数值，通过隶属函数值来评价2种月季的耐热性[11]。公式如下:若耐热指标与耐热性正相关，其公式为：

U(xi)=(xi-ximin)/(ximax-ximin)，i=1,2,3,…,n

若耐热指标与耐热性负相关，其公式为：

U(xi) = 1-(xi-ximin) /(ximax-ximin)

式中，U为隶属函数值；xi为某项指标测定值；ximin、ximax为所有参试材料中该项指标的最小值和最大值。

(2)耐热性主成分分析权重系数计算方法[12]如下：

Wi=pi/∑pi,i=1,2,3,…,n

其中，i表示各指标，pi为各种指标在第i各主成分的贡献率，Fij表示该指标在第j主成分上的负荷量，Yij表示第j主成分的贡献率，Wi表示第i各主成分在所有主成分中的重要程度。

(3)耐热性综合指数计算方法[11]如下：

D=∑[U(xi)×Wi],i=1,2,3,…,n

其中，D代表供试材料耐热性综合指数，D越大表示其耐热性越强，反之则越弱。

采用Excel软件处理数据，采用SPSS 20.0软件进行显著性分析、主成分分析，采用Origin 9.0进行制图。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对2种月季生理指标的影响

2.1.1 2种月季LT50的确定 根据相对电导率拟合的Logistic方程可得出2种月季的LT50(表1)。由表1可知,月月红和月月粉的拟合度(R2)分别为0.94、0.79，均达到了显著水平(P<0.05)。月月红、月月粉的LT50分别为49.33、50.04 ℃。

表1 不同高温处理下月月红和月月粉的LT50

注：*、**表示显著、极显著。

Note:*,** indicate significant,extremely significant difference.

2.1.2 细胞膜透性 由图1A可知，2种月季的Rec随高温胁迫时间延长均逐渐升高。2种月季不同胁迫时间的Rec均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2 h，月月红与CK无显著差异，月月粉与CK差异显著；高温胁迫6～12 h，2种月季均与CK差异显著，月月红Rec显著上升，月月粉无显著变化；高温胁迫12～24 h，月月红和月月粉的Rec均显著上升。

由图1B可知，2种月季的MDA含量随高温胁迫时间延长均呈先上升后下降的趋势。2种月季不同胁迫时间的MDA含量均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2～12 h，2种月季MDA含量均显著高于CK；高温胁迫24 h，月月红与CK无显著差异，月月粉与CK差异显著。

不同小写字母表示在0.05水平差异显著,下同

2.1.3 渗透调节物质 如图2A所示，2种月季的SP含量随高温胁迫时间延长均呈现先上升后下降再上升的趋势。2种月季不同胁迫时间的SP含量均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2 h，2种月季的SP含量均与CK无显著差异；高温胁迫6 h，2种月季SP含量均与CK差异显著，且达到最大值；高温胁迫12 h，2种月季SP含量均下降；高温胁迫24 h，月月红与CK无差异显著，而月月粉与CK差异显著。

如图2B所示，随高温胁迫时间延长，月月红Pro含量呈现先升高后下降的趋势，月月粉则呈现先上升后下降再上升的趋势。2种月季不同胁迫时间的Pro含量均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2～6 h，月月红Pro含量均与CK差异显著，月月粉均与CK差异不显著，且月月红Pro含量显著上升；高温胁迫12 h,2种月季的Pro含量均与CK差异显著；高温胁迫24 h，月月红与CK差异不显著，月月粉与CK差异显著。

由图2C可知，2种月季SS含量随高温胁迫时间延长均呈现先上升后下降的趋势。2种月季不同胁迫时间的SS含量均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2 h,2种月季的SS含量与CK相比均无显著差异；高温胁迫6 h，2种月季SS含量均与CK差异显著，且月月红SS含量达到峰值；高温胁迫12 h，月月红SS含量与CK无显著差异，而月月粉SS含量与CK差异显著且达到峰值；高温胁迫24 h，月月红与CK无显著差异，而月月粉与CK差异显著。

图2 高温胁迫下月月红和月月粉SP、Pro、SS含量的变化Fig.2 The change of soluble protein, proline and soluble sugar content of Slater and Old Blush under high temperature stress

2.1.4 SOD活性 如图3所示，2种月季SOD活性随高温胁迫时间延长均呈先上升后下降的趋势。2种月季不同胁迫时间的SOD活性均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2 h，月月红与CK无显著差异，而月月粉则差异显著；高温胁迫6 h，2种月季均与CK差异显著，且月月红的SOD活性达到峰值；高温胁迫12 h，2种月季均与CK差异显著，且月月粉的SOD活性达到峰值；高温胁迫24 h，2种月季SOD活性均与CK差异显著。

图3 高温胁迫下月月红和月月粉SOD活性的变化Fig.3 The change of SOD activity of Slater and Old Blush under high temperature stress

2.1.5 Chl含量和叶绿素荧光参数 如图4A所示，随着高温胁迫时间延长，月月红的Chl含量呈现先下降后上升的趋势，月月粉的Chl含量呈下降趋势。2种月季不同胁迫时间的Chl含量均差异显著(P<0.05)。高温胁迫2 h,2种月季的Chl含量均与CK无显著差异；高温胁迫6～12 h，2种月季均与CK差异显著；高温胁迫24 h，月月红与CK无显著差异，而月月粉则差异显著。

如图4B—4G所示，随着高温胁迫时间延长，2种月季的Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均呈现下降的趋势，qN、Fo呈现缓慢上升趋势。2种月季不同胁迫时间的叶绿素荧光参数均具有显著差异(P<0.05)。高温胁迫2 h，除月月红Fo外，2种月季其余各指标均与CK差异显著；高温胁迫6 h,2种月季的所有叶绿素荧光参数均与CK差异显著，其中，Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′显著低于CK，而qN、Fo显著高于CK；高温胁迫12～24 h，月月红Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均显著下降，而月月粉除Fm、Fv′/Fm′显著下降外，qP、ETR无显著变化，月月红的qN与Fo均显著上升，月月粉则表现为Fo显著上升，而qN无显著变化。

2.2 2种月季耐热指标的筛选

对月月红和月月粉13项指标进行主成分分析，通过各指标的贡献率可得知各指标的重要性。由表2可知，月月红、月月粉3个主成分的累计贡献率分别达到了93.579%、95.841%。月月红第1主成分贡献率为56.410%，包括Rec、qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo等7项指标，反映了高温胁迫对细胞膜透性和光合作用的影响，月月粉第1主成分贡献率为74.114%，包括Chl含量、SS含量、Rec、Pro含量、MDA含量、qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo等指标，主要反映高温对膜透性、渗透调节物质和光合作用的影响；月月红第2主成分贡献率为25.992%，包括SS含量、SP含量、SOD活性、MDA含量等4项指标，主要说明了高温胁迫对膜透性、渗透调节物质和保护酶活性的影响，月月粉第2主成分贡献率为13.906%，指标为SOD活性，反映了高温胁迫对保护酶的影响；月月红第3主成分贡献率为11.178%，包括Pro含量、Chl含量，主要反映了叶绿素情况，月月粉第3主成分贡献率为7.821%，主要指标为SP含量，反映了高温对渗透调节物质的影响。

图4 高温胁迫下月月红和月月粉Chl含量、Fm、qP、ETR、qN、Fv′/Fm′、Fo的变化Fig.4 The change of Chl content,Fm,qP,ETR,qN,Fv′/Fm′,Fo of Slater and Old Blush under high temperature stress

综上所述，月月红生理指标Rec、SS含量、SOD活性、MDA含量和荧光参数qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo载荷量较大，可作为月月红耐热性的鉴定指标；月月粉生理指标Chl含量、SS含量、Rec、SOD活性和荧光参数qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo载荷量较大，可作为月月粉耐热性的鉴定指标。

表2 月月红和月月粉耐热指标主成分分析

2.3 2种月季耐热性综合评价

通过对2种月季的Chl含量、SS含量、SP含量、SOD活性等13项指标的耐热性隶属函数值进行计算，并根据主成分分析结果对各指标进行合成，获得2种月季的耐热性综合指数(D)(表3)。月月红的综合指数为0.520，月月粉的综合指数为0.496，说明月月红的耐热性稍强于月月粉。

表3 月月红和月月粉耐热指标隶属函数值Tab.3 Heat resistance index membership function value of Slater and Old Blush

3 结论与讨论

众多研究表明，高温胁迫下，植物的生理代谢及光合作用会发生不同程度的变化，主要表现为叶绿素降解，细胞膜透性增大，活性氧含量增加，启动抗氧化酶和非酶抗氧化物质发生应答性变化[13]，以及光合作用过程中光能的吸收和转化、能量转运和PSⅡ的活性等,在植物光合作用与环境关系的研究中起着重要作用[14]。前人研究认为，本试验中所有生理指标均能作为月季耐热性鉴定指标，而本试验通过对13个指标进行主成分筛选，认为生理指标Rec、SOD活性、SS含量、MDA含量、Chl含量和荧光参数qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo与月季的耐热性密切相关。

高温会导致膜内脂的变化，使其细胞膜透性增大，细胞内电解质会有不同程度的外渗，伤害越大，外渗越大，电导率增加越大[15]。在高温胁迫下随着胁迫时间增加，2种月季Rec均显著增大，与杨华庚等[16]研究蝴蝶兰的结果一致。MDA是膜脂过氧化产物之一，随着膜伤害的发生，使其体内可溶性物质大量渗漏[17]。本研究表明，随着高温胁迫时间的延长，2种月季MDA含量呈先升后降趋势，在处理6 h均达到峰值，随后下降，可能是由于胁迫强度太大导致不能正常合成MDA，月月红胁迫24 h与CK无显著差异，而月月粉差异显著，说明高温对月月粉伤害更显著。

SP和Pro都是重要的渗透调节物质，植物遭受高温会主动积累SP、Pro，以此来抵御高温带来的伤害[18-19]。本试验中，2种月季SP、Pro含量随着胁迫时间延长均有不同程度的增加，说明Pro、SP在月季抗高温机制中有较大作用。且月月红SP含量明显高于月月粉，说明月月红抵御高温能力强于月月粉。2种月季SS含量呈先上升后下降的趋势，月月红在胁迫6 h达到峰值，随后下降，月月粉在12 h达到峰值后下降，这与叶小梅等[20]研究的高温胁迫下月季SS含量变化趋势一致，胁迫前期通过积累SS抵御高温，胁迫后期可能是由于高温下植物呼吸作用大于光合作用，消耗体内SS，从而造成SS含量下降。但在胁迫24 h后，月月红与CK无显著差异，月月粉差异显著，说明高温对月月粉伤害更大。

有研究表明，SOD活性与植物耐热性息息相关，并随高温胁迫时间延长呈先上升后下降的趋势[21-22]，这与本试验中所显示趋势一致，出现这种趋势的原因可能是胁迫前期，植物自身能够提高SOD活性来抵御高温伤害，后期胁迫时间过长而超过植物本身的承受能力，使得酶活性下降[15]。本试验中，月月红处理6 h达到峰值，且SOD活性明显高于月月粉，说明此期间月月红抵御高温能力更强，而月月粉则在处理12 h后达到峰值，说明月月红对高温响应主要在胁迫前期，月月粉在后期。

PSⅡ对逆境胁迫非常敏感，高温会导致其结构和功能发生变化[23]。研究表明，qP、qN、ETR、Fm、Fv′/Fm′、Fo均与植物耐热性有关[24-25]。本试验中，45 ℃的高温能够诱导2种月季的Fo、qN上升，钟敏等[14]认为，Fo上升可能是高温使PSⅡ反应中心产生破坏，从而导致电子传递受阻，qN上升说明高温使叶片光能热耗散增加，有利于耗散过剩光能，从而适应高温。高温下2种月季的Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均随胁迫时间延长呈下降趋势，且均在处理24 h达到最低值，表明高温使PSⅡ反应中心光化学转换效率下降。就2种月季而言，月月红胁迫2 h后Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′下降幅度最大，而月月粉在胁迫6～12 h下降波动最大，说明胁迫前期月月红对高温的响应明显，而月月粉响应高温主要在后期，前人研究中也有类似结果[26]。此外，Chl含量与植物光合效率密切相关，植物叶片的受损情况能够反映高温对植物的伤害程度。高温会导致月季Chl含量下降[26]。本试验中，月月红Chl含量呈先下降后上升的趋势，月月粉Chl含量呈下降趋势，后期上升可能是由于胁迫时间短，没有达到抑制光合作用的程度，叶绿素不稳定[27]。胁迫至24 h，月月红Chl含量与CK差异不显著，而月月粉差异显著，说明高温对月月粉伤害更明显。

本研究从生理特性及叶绿素荧光方面初步探讨了2种月季的耐热机制和应激反应，筛选出与月季耐热性相关的指标，并进行耐热性评价。高温对植物的影响是多方面的，可以利用生理特性和叶绿素荧光来分析植物受逆境伤害程度。后期可考虑从热激蛋白或热激转录因子等方面深入分析其耐热机制。