HPLC法测定不同产地女贞子中红景天苷、女贞苷、特女贞苷的含量

2019-04-20李彦灵龚曼曾凡一位慧芸王夏影闫福林

中医药学报 2019年2期

李彦灵，龚曼，曾凡一，位慧芸，王夏影，闫福林*

(1.新乡医学院三全学院，河南新乡 453003；2.河南中医药大学，河南郑州 450046)

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实，是一味补肾滋阴、养肝明目的中药，可用于肝肾不足、头晕耳鸣、头发早白及两目昏糊等病症[1]。主要化学成分有三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇类、黄酮类、梓醇、醌类、挥发油、脂肪酸、磷脂等成分[2-6]，现代药理研究发现女贞子具有抗骨质疏松、抗肿瘤、保肝、降血糖、降血脂、调节免疫等作用[7-9]。女贞子主要产于我国的河南、陕西、江苏、长江流域等地，在各地也有种植。当前药材市场上的女贞子存在以次充好的现象，危害大众的健康，需要对女贞子药材进行质量控制，保障临床用药的安全性。因此本文应用HPLC法对不同产地的女贞子药材进行指标性成分的测定，为女贞子药材的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，UV检测器，FA2004电子F分析天平(批号：14D101-1000，上海良平仪器仪表有限公司)；HH恒温水浴锅(金坛市中大仪器厂)；旋转蒸发仪(R206)(上海申生科技有限公司)；SHZ-3循环水式多用真空泵、CCA-420低温冷却水循环泵(郑州杜普仪器厂)。

红景天苷(批号：B20504)、女贞苷(批号：B20924)、特女贞苷(批号：B21240)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇均为色谱纯；水为超纯水。实验用女贞子样品均由安徽普仁中药饮片有些公司提供，经新乡医学院三全学院苏慧慧鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相水-乙腈，梯度洗脱：0～2 min，5%乙腈；2～40 min，5%～30%乙腈；40～45 min，30%乙腈；45～50 min，30%～5%乙腈。体积流量1.0 mL/min，检测波长282 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液的配制

精密称取红景天苷、女贞苷、特女贞苷对照品适量，使配成0.152 mg/mL、1.00 mg/mL、1.00 mg/mL的混合对照品溶液，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，接取续滤液，备用。

2.2.2 供试品溶液的配制

精密称取过4号筛的女贞子粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入95%的甲醇溶液25.0 mL，称重，超声30 min，室温放置10 min，再称重，并用95%的甲醇溶液补足减失的重量。静置20 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，接取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

精密吸取对照品溶液5、10、12.5、15、20 μL进样，记录各浓度下的色谱峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。红景天苷、女贞苷、特女贞苷的回归方程、相关系数及线性范围分别为：Y=21 899X-22 883，r=0.999，0.76～3.04 μg；Y=66 272X-24 395，r=0.999 1，5.00～20.00 μg；Y=93 479X+23 418，r=0.999 9，5.00～20.00 μg。

2.4 系统适应性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入高校液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件进行测定，红景天苷、女贞苷、特女贞苷色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数大于3 000，具体见图1。

注:1.红景天苷;2.女贞苷;3.特女贞苷图1 对照品(A)及女贞子样品(B)HPLC图

2.4.1 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录各对照品色谱峰面积，红景天苷、女贞苷、特女贞苷峰面积的RSD值分别为0.55%、0.48%、0.85%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

精密称取女贞子S6样品共5份，按“2.2.2”项下平行制备5份供试品溶液，按“2.1”项下色谱方法进样，结果红景天苷、女贞苷、特女贞苷峰面积的RSD值分别为1.02%、2.11%、0.98%，表明方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

精密吸取女贞子S1样品6份，按“2.1”项下色谱方法分别在0、1、2、4、6进样分析，记录各对照品色谱峰面积，结果红景天苷、女贞苷、特女贞苷峰面积的RSD值分别为2.51%、3.05%、2.11%，表明供试品在常温条件下放置6 h稳定性良好。

2.4.4 加样回收率试验

精密称取已知对照品含量的女贞子S2样品5份，每份0.5 g，分别加入红景天苷、女贞苷、特女贞苷对照品适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各对照品色谱峰面积，计算回收率。具体结果见表1。

2.5 样品测定

取10批不同产地的女贞子药材，按“2.2.2”项下制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，结果如表2。

3 讨论

建立符合中医药“整体性”作用特点的质量评价体系，是当前中药现代化进程中迫切需要解决的一项艰巨任务。中药作用的整体性、组成成分的多样性、作用靶点的复杂性、以及成分间相互作用的难以预测性，使得检测单一活性成分的西药质控方法在中药领域中行不通[10]。中药作用的发挥是依靠多种成分的共同作用而实现的，这一观点已经成为共识，利用多种成分分析来控制中药质量已经成为主流。随着中药用药有效性、安全性问题日益得到重视，建立高品质的评价标准以保证药材的质量是一项长期而艰巨的任务[11-13]。

红景天苷是具有苯乙醇结构的苷类成分，研究结果表明其具有保肝、抗肿瘤、增强免疫等多种药理作用[14-15]。女贞苷、特女贞苷为裂环环烯醚萜苷类成分，是女贞子的特征成分[16-17]。崔蕴慧等[18]对女贞子的指纹图谱及红景天苷、特女贞苷含量进行测定发现红景天苷的含量在0.060%～0.294%，特女贞苷含量在0.473%～2.149%。参考杨光明等的方法[19]红景天苷、女贞苷、特女贞苷分别在282 nm处有最大吸收，因此本文选用282 nm作为测定波长。实验结果显示红景天苷、女贞苷、特女贞苷分别在进样量0.76～3.04 μg(r=0.999 9)、5.00～20.00 μg(r=0.999 1)、5.00～20.00 μg(r=0.999 9)范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.19%、100.27%、100.46%。10个产地女贞子药材红景天苷、女贞苷、特女贞苷含量分别在2.06～4.34 mg/g、2.52～28.73 mg/g、8.86～46.84 mg/g范围。红景天苷含量以河南平顶山产女贞子最高(4.34 mg/g)，女贞苷、特女贞苷含量以河南产为最高(28.73 mg/g、46.84 mg/g)。而安徽产女贞子红景天苷、女贞苷、特女贞苷的含量均低，分别为2.27 mg/g、10.08 mg/g、14.21 mg/g。这与任爽、邹小燕等[20-21]的研究相一致。