辣木叶通便复方对小鼠通便作用的研究

张久旭，刘洋，李梦薇，顾文宏，龙兴芬，赵保胜*

(1．北京中医药大学，北京 102488；2.云南天佑科技开发有限公司，云南 芒市 678400)

辣木为多年生速生树，原产于印度，又称为鼓槌树，奇迹之树，全世界约有14个品种[1]。辣木叶粉含有丰富的维生素、蛋白质以及氨基酸，其营养价值与现代营养学家称为“人类营养的微型宝库”的螺旋藻相当[2]，在食品领域得到了广泛应用，近些年在医学领域也越来越受欢迎，调查显示，辣木叶粉有降血糖、降脂、降压、改善睡眠等功效，长期食用可增强人体免疫功能，延缓衰老、预防疾病。在印度传统医学研究中，辣木叶性凉，具有通便、促进消化的作用[3]。贺银凤等人研究也表明了辣木叶具有明显的通便作用[4]。

辣木复方叶由辣木叶、黄芪、白术组成，临床应用具有较好的通便作用。本实验在临床研究基础上，观察辣木叶复方对便秘模型小鼠的通便作用，并观察黄芪、白术与辣木叶的协同作用。

1 材料

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

辣木叶：由合作企业(云南天佑科技开发有限公司)提供；黄芪(批号：1611020，北京太洋树康中药饮片厂)；白术(批号：1609003，北京太洋树康中药饮片厂)；硫糖铝(批号：11403077，北京虹湖联合化工产品有限公司)；曙红(批号：E100232，北京伊诺凯科技有限公司)；乙腈(色谱纯，Fisher公司，批号：164790)；甲醇(分析纯，北京化工厂，批号：20170209)；磷酸(分析纯，北京化工厂，批号：20160111)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司，批号：201102GQ07547)；异槲皮苷(纯度92.9%，111809-201403,中国食品药品检定研究院)；紫云英苷(纯度99.5%，批号：Y27J7H9634,上海源叶生物科技有限公司)；芦丁(纯度98%，批号：170124，北京四面体生物科技有限公司)。

1.1.2 实验药物的制备方法

实验分组：辣木叶低剂量组(10 g/d)、辣木叶中剂量组(15 g/d)、辣木叶高剂量组(20 g/d)，黄芪白术组10g/d，复方组合①(辣木叶10 g/d+黄芪白术(10 g/d)、复方组合②(辣木叶15 g/d+黄芪白术10 g/d)、复方组合③(辣木叶20 g/d+黄芪白术10 g/d)

辣木叶干燥粉末：称取辣木叶97.93 g于2 000 mL圆底烧瓶，加100 mL蒸馏水，浸泡2 h。回流提取2 h，保持微沸状态，用纱布过滤，收集初滤液，再加入1 000 mL蒸馏水，回流提取2 h，合并2次的滤液，旋转蒸发浓缩至一定体积，将浓缩后的药液倒入蒸发皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，得到辣木叶干燥粉末。

复方干燥粉末：以2倍处方量称取各药材，按不同的实验分组分别进行水回流提取，纱布过滤，放置过夜，滤去沉淀，旋转蒸发仪浓缩至一定体积，得浓缩液，60℃水浴浓缩至流浸膏，得到不同复方干燥粉末。

1.1.3 化学试剂及其配制

硫糖铝混悬液配制：取硫糖铝试剂0.2 g，取0.5 g羧甲基纤维素钠，加入100 mL水，配制成质量浓度为2 mg/mL 的溶液。

曙红溶液配制：取1 g曙红，加入100 mL去离子水溶解，得到澄清、朱红色的溶液。

1.1.4 实验动物

ICR小鼠100只(由北京斯贝福生物科技有限公司提供，生产许可正号:SCXK(京)2016-0002)，SPF级，雌雄各半，体质量18～22 g。

1.1.5 仪器和设备

电子分析天平：Sartorius BSA2202S(济南恒则成仪器有限公司)；旋转蒸发仪：RE-52AA型(上海亚荣生化仪器厂)；恒温水浴锅：XMTD-6000型(济南温腾医疗器械有限公司)；真空干燥箱：TAISITED 2-2BC型(上海索普机械有限公司)；紫外可见分光光度计(TU-1810，普析)；岛津高效液相色谱仪(LC-16，日本岛津公司)。

2 实验方法

2.1 总黄酮含量的测定

2.1.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁14.94 mg，加入70%乙醇溶液超声溶解，定容至100 mL容量瓶中。准确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入25 mL刻度比色管中，加入30%乙醇至5 mL，后加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，30%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀后用1 cm比色皿在510 nm处测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到芦丁的线性回归方程为y=0.001 3x-0.027 3，r2=0.999 9，芦丁浓度在73.21～585.54 μg/mL范围内，与吸光度呈良好的线性关系。如图1所示。

图1 芦丁线性回归方程

2.1.2 样品总黄酮含量测定

根据实验分组，各精密称取0.25 g不同样品干燥粉末，每个样品平行称取6份，加入25 mL 70%乙醇溶液，超声30 min溶解，冷却，补足称重。准确吸取1 mL移入25 mL比色管中，按“2.1.1”项下测定吸光度。

2.1.3 精密度试验

取1 mL供试品溶液至25 mL比色管中，按“2.1.1项下”操作，连续6次测定吸光度，RSD值为0.14%，表明仪器的精密度良好，可以满足含量测定的要求。

2.1.4 稳定性试验

分别取适宜浓度的对照品溶液和供试品溶液于0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h测量吸光度，RSD值分别为1.45%和1.47%，表明对照品和样品在4 h内稳定。

2.1.5 重复性试验

精密称取供试品约0.5 g，按照供试品的制备方法制备样品6份，按照“2.1.1项下”测定吸光度，以吸光度计算RSD值为1.83%。说明本测定的方法的重现性良好。

2.1.6 加样回收率试验

取装量差异下的木叶通便复方②6份，各0.25 g，精密称定，加入芦丁适量，按照供试品制备方法制备样品。测定吸光度，计算各对照品的平均加样回收率和RSD值。结果见表1。

表1 辣木叶通便复方回收率测定结果(n=6)

2.2 指标性成分的含量测定

2.2.1 对照品溶液制备

分别取异槲皮苷对照品10.00 mg、紫云英苷对照品10.60 mg置10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得异槲皮苷浓度为1.00 mg/mL和紫云英苷浓度1.06 mg/mL对照品储备液溶液。分别吸取异槲皮苷对照品储备液4.8 mL和紫云英苷对照品储备液2.2 mL于10 mL容量瓶中定容至刻度作为混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

根据实验分组分别取不同辣木叶通便复方样品、辣木叶单味样品、黄芪白术组样品粉末各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入50 mL甲醇，称重。超声(300 W,40 kHz)溶解30 min后取出，放冷，称重，加入纯甲醇补足重量，摇匀，静置，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得各组供试品溶液。

2.2.3 色谱条件

色谱柱为Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脱，洗脱程序为：0～16 min 20%B,16～28 min 20%～50%B,18～22 min 50%B,22～23 min 50%～20%B,30 min 20%B；流速为1.3 mg/mL，柱温为40℃，检测波长为350 nm。进样量为10 μL，上述色谱条件下，分析对照品和样品。

2.3 通便实验

2.3.1 实验动物分组方法

取ICR小鼠90只，雌雄各半，体质量18～22 g，按体质量随机分为模型对照组，辣木叶低剂量组(10 g/d)、辣木叶中剂量组(15 g/d)、辣木叶高剂量组(20 g/d)，黄芪白术组(10 g/d)，复方组合①(辣木叶10 g/d+黄芪白术(10 g/d)、复方组合②(辣木叶15 g/d+黄芪白术10 g/d)、复方组合③(辣木叶20 g/d+黄芪白术10 g/d)，每组10只小鼠。

2.3.2 小鼠便秘模型的建立

实验前各组小鼠正常饮水， 除空白组外各组小鼠均灌以质量浓度为2 mg/mL 的硫糖铝混悬溶液。 每天按 0.5 mL/只灌胃小鼠 1 次，连续 3 d ，第 4 天剂量减半，结果模型组小鼠出现首粒排便时间延长，4 h内排便粒数减少等表现。

2.3.3 辣木叶通便实验

第4天分别给各组小鼠称重，并记录体质量。灌胃给药硫糖铝2 h后，按体质量给实验组给药。 阴性对照组和空白对照组每只小鼠灌以 0.5 mL蒸馏水, 灌制的液体中均混有曙红溶液, 以便更好地观测粪便颜色。各组小鼠单笼分养, 正常饮水、进食, 分别观察记录每只小鼠首次排出红便时间和4 h内排便数量以及粪便干燥后的重量。

2.4 统计学方法

3 结果与分析

3.1 各样品总黄酮含量测定结果

从总黄酮的含量测定结果来看，通便复方中的总黄酮主要来源于辣木叶，但经黄芪、白术配伍后，总黄酮含量明显增多，并且以复方组合②增加的最明显。各样品总黄酮含量测定结果见表2。

3.2 各样品指标性成分含量测定结果

从高效液相色谱法测定结果来看，按日服用生药量计算，通便复方中选定的指标性成分异槲皮苷和紫云英苷的含量分别为61.699 mg,31.796 mg，辣木叶单味药中异槲皮苷和紫云英苷的含量分别为40.386 mg,21.412 mg，复方中异槲皮苷和紫云英苷含量较辣木叶单味药分别多21.313 mg,10.384 mg。各样品指标性成分含量测定结果见表3。

表2 各样品总黄酮含量测定结果(n=6)

表3 各样品指标性成分含量测定结果(n=3)

3.3 小白鼠便秘模型的建立

除空白组外其它各组小白鼠灌胃硫糖铝混悬液0.5 mL，有效成分浓度为2 mg/mL。空白对照组小鼠灌胃等量蒸馏水,观测小白鼠排首便的时间。从表1可以看出,灌胃硫糖铝的阴性对照组首次平均排便时间为104.80 min，灌胃蒸馏水的空白对照组首便平均时间为36.3 min，相差68.5 min，差异有统计学意义(P<0.001)。可以表明便秘模型成功建立[5-6]。

3.4 辣木叶及其复方对便秘模型小鼠首便时间的影响

在成功建立便秘模型的基础上,对小鼠进行通便实验研究,并设蒸馏水阴性对照组，结果见表4。由表中数据可以看出,通过阴性对照组与各实验组的比较,多数实验组首便时间明显缩短，辣木叶及其复方与黄芪白术组对小鼠首便时间均有显著有影响。实验结果表明，三者均对小鼠的首次排便时间有作用，但复方2的作用效果明显高于其他试验组(P<0.001)。

3.5 辣木叶及其复方对便秘模型小鼠排便量的影响

测定各组小鼠在灌胃给药后4 h内排便粒数和干粪便的重量,辣木叶及其复方对排便粒数及粪便干重影响显著，但黄芪白术组对排便粒数及粪便干重影响不明显。实验结果表明，辣木叶及其复方灌胃给药对便秘小白鼠的排便量均有显著的影响。

表4 辣木叶及其复方灌胃给药对小鼠通便作用的影响

注：与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05

4 讨论

便秘为大肠传导功能失常所致，但与脾胃肝肾等脏腑的功能失调有关。目前随着人们生活节奏的加快和饮食结构的改变，便秘患者日益增多，相当一部分便秘患者就诊前曾受广告影响、他人介绍而自行选择泻剂治疗其便秘，这种没有专业基础作指导的用药，常常发生不合理用药的情况，引起一些原本可避免的副反应[7]。

目前对辣木叶通便作用的研究也有诸多报道，但对辣木叶复方通便作用的研究还未见报道，本次实验以小鼠首便时间和4 h内粪便的粒数和干燥后的重量为指标，研究辣木叶及其复方灌胃给药对小鼠通便作用的影响。结果显示，辣木叶及其复方灌胃给药对便秘小鼠具有明显的通便作用，即明显缩短小鼠首便时间并且增加了小鼠的排便重量，且辣木叶复方组②(辣木叶15 g/d+黄芪白术10 g/d)的整体通便作用更为明显。

经过研究与查阅文献可知，辣木叶主要含有黄酮类化合物[8-9]，本次实验选择了异槲皮苷和紫云英苷为指标性成分，二者均为黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、镇痛等药理作用[10-11]，有研究表明，具有抗氧化、抗炎作用的药物和天然产物能够保护肠黏膜的完整性，促进慢性传输型便秘肠道功能的恢复[12-13]。通便复方中的总黄酮主要来源于辣木叶，但经黄芪、白术配伍后，总黄酮含量明显增多，并且此差值比黄芪、白术二味药配伍后总黄酮值高出6倍，可能是由于辣木叶通便复方中黄芪含有大量皂苷类成分，有助溶性，可促进其他成分在水中的溶解度，配伍之后的黄酮含量明显增加，并且复方中指标性成分含量也显著增加，从而说明复方中各药的化学成分在提取制备过程中，对其他成分产生助溶作用，可以在一定程度上表明复方配伍的优越性，同时也侧面佐证了辣木叶通便复方的通便作用。总黄酮及异槲皮苷和紫云英苷的含量测定结果结合通便药理实验结果表明，辣木叶通便复方配伍较单味辣木叶、去辣木叶复方具有更高含量黄酮类成分，为其药效提供了一定的化学物质基础的数据支撑，为辣木叶复方的进一步深入研究奠定了一定的基础。