交叉引物等温扩增技术在EHEC检测中的应用

刘文鑫 袁超文 冯瑜菲

肠出血性大肠杆菌O157：H7是一种比较常见的血清型菌株，其会导致患者出现出血性结肠炎或者是溶血性尿毒综合症等一系列对患者的身体健康造成严重伤害的疾病[1]。在感染O157：H7之后，疾病的发展速度比较快，患者的病情如果再短期内无法得到控制极有可能死亡，在世界各国都曾有因O157：H7感染暴发所导致的大范围死亡情况出现，这种感染对公众的生命健康造成了极其严重的威胁，引起世界卫生部门的广泛关注。因此，必须要建立起兼备特异性、灵敏度与快速性的检测方法，对O157：H7进行快速检测[2]。在现阶段，我国仍然沿用传统的GB/T4789.4-2010作为对O157：H7进行检测的依据，其在实践中已经暴露出了越来越多的缺点，采用这种方法来进行检测消耗的时间比较长，检出率也比较低，不能做到快速检测。ELISA和PCR等检测方法也可以对O157：H7进行检测，且检测的速度比较快，但是，需要注意的是，采用这些检测方法时仍然存在缺陷，或是特异性不够高，或是灵敏度比较低，操作起来比较困难，在检测实践中不易上手，对检测人员、场地和设备的要求相对来说都比较高，不能适应出入境口岸的检测速度要求[3-4]。交叉引物等温扩增技术（CPA）是近年来研究出的一种新型检测技术，其反应系统由交叉引物、玻璃引物和监测探针组成，主要由BstDNA聚合酶及MgSO4等具备DNA链置换功能的成分构成，通过基于胶体金免疫层析技术的核酸试纸条，这些反应成分的扩增产物可以展开特异性检测[5]。交叉引物等温扩增技术的扩增温度一直保持同一个数据，在进行检测的过程中，所需要使用的操作设备为普通的加热器，检测在密闭环境中进行，肉眼可见检测结果，所以对反应条件和技术人员检测技术的要求也相对较低，完全避免了交叉污染所造成的假阳性反应出现[6]。在此次研究当中，对应用交叉引物等温扩增技术来进行肠出血性大肠杆菌O157：H7的特异性、灵敏度、准确性以及检测所耗时间进行了分析，以期对在实践中应用此种检测方法的实用性进行探究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品与菌株

食品检测样品。在此研究当中所使用的食品检测样品共70例。

菌株。研究中所用的肠出血性大肠杆菌O157：H7共计三株，包括标准株和地方株。除此之外的13株分别是肠产毒型大肠埃希菌、福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血弧菌、幽门螺杆菌、空肠弯菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分杆菌、产气荚膜梭菌、假丝酵母菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、化脓性链球菌。金黄色葡萄球菌、结核分杆菌、产气荚膜梭菌购自广东省微生物研究所，其他菌株从中国药品和生物制品鉴定研究院买入。

1.2 仪器

在此次研究当中使用的设备分别是：购自于BioRad公司的荧光定量PCR仪以及购自于生物梅里埃公司的全自动微生物鉴定仪。

1.3 试剂及培养基

此次研究当中所使用的试剂盒分别是：购自北京百奥莱博的O157：H7实时荧光定量PCR试剂盒、购自于上海拜诺生物科技公司的DNA快速提取试剂盒以及大肠杆菌O157：H7检测试剂盒。

此次研究当中所使用的培养基分别是：购自于广东环凯生物科技公司的普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、山梨醇麦康凯培养基以及购自于宁波天润公司的肠出血性大肠杆菌O157：H7诊断血清。

1.4 方法

1.4.1 模拟食品样本及菌株DNA模板的制备 首先需要将本次研究所需要的16种菌株在普通平板或者是血平板上进行接种，培养温度保持在37℃，培养时长则应该控制在18～24 h，选取单个菌落提取细菌DNA，在提取过程当中应该严格按照试剂盒上的操作说明来进行提取。

模拟实物样本则需要在实验购入的普通营养肉汤当中进行增菌，培养温度保持在37℃，培养时长则应该控制24 h左右，在吸取增菌液之后采用试剂盒进行细菌DNA提取工作。

1.4.2 CPA引物与探针的设计 在此次研究中CPA引物与探针需要根据O157：H7的基因特征保守型序列进行设计[7-8]。其中，扩增产物以及各引物、探针的序列为：

C A G T C G T A C C G G G A T C C A G A T A A A T C G CC A T T C C T T G A C T A C T T C T T A T C T G G A T TT A A T G T C C C A T A G T G G A A C C T C A C T G A C GC A G T C T G T G G C A A G A G C G A T C T T A C GG T T T G T T A C T G T G A C A G C T G A A C C T TT A C C T T T T C G G C A A A T A C A G A G G GG A T T T C G T A C A A C A C T G G A T G A T C T C A G TGGCCGTTCTTATGTAATGACTCCTGA

剥离引物的序列为：

EHECVT1F3：5-CAGTCCTACGGGGATCCAG

EHECVTIB3：5-TCACCAGTCATTACATAAG

交叉引物的序列为：

E H E C V T I C P F 2：5-G C T C T T G C C A C A G A C TGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT

检测探针的序列为：

EHECVTIDR5B：5BIOTIN-CCTCTTCCCA-CAGACTCCCTC

EHECVT1DR5F：5FTTC-AGGTTCCCCTAT-CCGACAT

1.4.3 CPA扩增反应及检测体系 在PCR反应管当中加入扩增反应试剂、ddH20和制备完成的DNA模板，剂量分别为：10 µL、6 µL和4 µL，总体积保持三项试剂相加数量不变，将其在反应管当中扩增1 h，温度控制为63℃。扩增完成之后将之放入检测装置，在检测中质控线和检测线都出现显色条带，假设显色深于比色卡条带颜色，则可以判定为阳性，若否之，则为阴性。

1.4.4 模拟食品样本中EHECO157：H7的检测 对采用CPA法进行检测过的EHECO157：H7为阴性的牛肉加入到磷酸盐缓冲液制成匀浆，牛肉数量为20 g，磷酸盐缓冲液剂量为80 mL，制作完成之后取1 mL接种EHECO157：H7标准菌株（浓度已知），在混匀之后将其作为模拟食品样本的原样，模拟70份含此菌株以及不含此菌株的样品，采用分离培养鉴定法、CPA法以及荧光定量PCR法等三种检测方法来进行检测。

1.5 观察指标

1.5.1 CPA-EHECO157：H7检测体系的特异性 取本次研究所选取的全部16株菌株在按照上述方法制备DNA模板之后进行扩增检测，对其特异性进行验证。

1.5.2 CPA-EHECO157：H7检测体系的敏感性 选取经过增菌培养之后的EHECO157：H7标准株的菌液，剂量选择为1 mL，采生理盐水按照10倍的比例来进行稀释工作，在LB平板上涂抹不同稀释倍数的培养物，温度保持在37℃的情况下培养8～10 h，培养时间为夜间，对每毫升培养物当中的菌落进行计数，与此同时，需要取以上各个浓度的稀释液制备各自的模板，并对其进行CPA以及荧光定量PCR检测，对检出浓度为各模板中最低的样本反复进行测定，最少测定次数为10次，若95%以上测定该样本为阳性，则可以确定最低检测值就是该浓度。

1.6 统计学处理

在此次研究当中的资料均使用SPSS 17.0来进行检测，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 CPA检测体系的特异性

所抽选的菌株当中只有3株EHECO157：H7菌株是呈阳性的，其余菌株的检测结果皆为阴性。

2.2 CPA检测体系的敏感性

标准株用琼脂平板培养计数法10倍梯度稀释，取理论浓度为107、106、105、104、103、102、101cfu/mL的样本，标记N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7，用CPA进行检测。结果为：N1～N6为阳性，N7阴性。

取最高稀释度为样本检测10次，阳性率达到100%，所以最低检出限为102cfu/mL。

2.3 模拟样本检测结果

采用荧光定量PCR以及CPA检测的结果，如表1所示。

由表1当中的数据可以计算出，以荧光定量为参考，CPA法的灵敏度为97.14%（34/35），特异性为91.42%，准确率为94.28%。

一致性：χ2=0.14，根据卡方界值表P＞0.05，证明两种检测方法的检测结果无差异性。

采用分离培养法以及CPA检测的结果如表2所示。

表1 荧光定量PCR以及CPA检测的结果（n）

表2 分离培养法以及CPA检测的结果（n）

由表2当中的数据可以计算出，灵敏度为97.22%（35/36），特异性为94.11%（32/34），准确率为97.14%（68/70）。

一致性：χ2=0.04，根据卡方界值表P＞0.05，证明两种检测方法的检测结果无差异性。

3 讨论

根据临床医学研究，肠出血性大肠杆菌O157：H7感染的致死率比较高，由这种感染所造成的食源性疾病已经造成了世界范围内的大问题，对食品安全造成极其不利的影响。因此，学界必须认识到对肠出血性大肠杆菌O157：H7所采用的检测方法的特异、灵敏以及快速的重要性，从而在实践中进行深入研究[9]。在现阶段，我国仍然沿用传统的GB/T4789.4-2010作为对肠出血性大肠杆菌O157：H7进行检测的依据，检测中的特异性相对来说比较低，灵敏度也比较差，检测所需要消耗的时间比较长，实用性极差。而荧光定量PCR等其他检测技术虽然相对来说检测速度比较快、各项特性都比较强，但是在进行检测的过程中对检测环境、设备和操作技术等都有着比较高的要求，实用性比较差，不适合投入到实践的检测工作当中[10]。

交叉引物等温扩增技术是一种近几年来发展出的新技术，这种技术要在恒温环境内进行，检测速度比较快，特异性比较高，且对检测设备和检测技术的要求都比较低，非常适宜投入到大范围的适用当中[11]。交叉引物等温扩增技术在反应原理、反应系统、检测等方面都较传统的等温扩增技术进行了创新与完善，DNA聚合酶作用于交叉引物和剥离引物，从而使多个扩增反应同时在同一模板上进行，扩增反应繁盛之后，许多单链DNA被置换出来，这些DNA可以继续参与到核酸扩增反应当中，同时也可同检测探针发生杂交反应，从而通过核酸试纸条完成特异性检测。

交叉引物等温扩增技术与其他等温扩增技术相比，有着独特的优越性：首先，这种技术相对来说完成反应所消耗的时间比较少，可以在比较短的时间内完成反应，对一些比较常见的病毒细菌DNA进行检测的过程中，其核酸扩增反应的完成之间大多控制在1 h左右；其次，这种技术操作起来比较简单，对反应条件的要求比较低，操作步骤比较简单，容易上手，对操作人员的技术要求比较低，适宜在大范围内进行普及；最后，这种技术在进行肠出血性大肠杆菌O157：H7检测时，需要的仪器相对其他检测方法来说也极其简单，普通的加热器就达到了检测标准要求[12]。

此次研究发现，采用交叉引物等温扩增技术来进行检测时，只有大肠杆菌O157：H7菌株的结果呈阳性，其他13株菌株均为阴性；其敏感度、特异性以及准确率都要优于其他检测方法，检出的速度相对来说也比较快。

综上所述，采用交叉引物等温扩增技术来进行肠出血性大肠杆菌O157：H7检测，对操作环境和操作人员的技术水平要求比较低，操作步骤简单易上手，检测特异性和灵敏度都比较强，因此检测的结果也更加准确，检测速度比较快，适用于我国出入境口岸的检测以及各种食物检测，较现阶段其他肠出血性大肠杆菌O157：H7检测方法有着不可超越的优越性。