子宫内膜异位症中nm23-H1和β-catenin基因表达及意义

王 玮，王 玥，段仁杰，曹慧茹，李铁臣，孙 青

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241002)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)[1]是一种常见的慢性病，发病年龄在月经初潮到更年期之间，有4～10年不等的诊断延迟期[2]，最新发现，已有月经初潮前发生EMs的案例报道[3-4]及绝经后EMs复发的案例报道[5]，子宫内膜异位症已经给女性的生活带来了不便。该病为良性疾病，但也可以浸润转移，具有恶性肿瘤的性质[6]，因而可能与癌症的发病机制有相似之处[1]。nm23-H1是极其重要的抑癌基因，β-连环蛋白(β-catenin)是一种常见的黏附分子。本实验主要采用原代培养间质细胞的方法，经转染nm23-H1的小干扰RNA，作用24～48 h后，检测两基因在两组细胞中的表达。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1～7月弋矶山医院妇产科经手术切除的EMs患者的病灶(卵巢)标本，患者年龄28～45岁，平均年龄(36.3±5.1)岁。正常组标本为同一时间从手术室取育龄期因输卵管因素、卵巢良性肿瘤、子宫肌瘤行腹腔镜探查、全子宫切除术或宫腔镜手术患者的正常子宫内膜，病理为增生期子宫内膜，患者年龄27～44岁，平均年龄(36.8 ± 5.6)岁，每组各10例。所有患者无其他疾病史，术前6个月内未使用激素药物。

病理结果均得到病理科的验证，将组织置于离心管中，加入含双抗的基础培养基，在冰浴下尽快送到实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用PBS冲洗，将新鲜的组织于离心管中剪碎，加入Ⅰ型胶原酶消0.5～1 h，离心后过滤得间质细胞，最后重悬接种，在37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 加药处理及检测 设置对照，加入nm23-H1的siRNA的转染试剂(50 nmol/L)，24～48 h后提取RNA，行荧光定量PCR检测各基因的相对表达量，各引物均由生物工程合成。其中本实验室前期已筛选出转染试剂的最适序列及最适浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0将数据进行分析，数据以均数±标准差表示。两组间的比较采用t检验，转染前后的数据采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两基因在正常组和EMs组中的表达 nm23-H1在正常内膜组和EMs组的间质细胞中表达水平分别为1.00±0.41、0.34±0.25，t=4.257，P<0.05，有统计学意义；β-catenin的表达水平分别为1.00±0.75、8.78±4.38，t=5.517，P<0.05，差异有统计学意义；说明EMs组中nm23-H1的表达水平较正常组低，而β-catenin表达水平变化呈相反趋势。

2.2 两基因在正常组、EMs组中转染前后的表达 两组细胞经过nm23-H1的小干扰RNA转染后，即沉默nm23-H1的表达，在免疫荧光显微镜下观察细胞如图1所示，siRNA转染进入细胞。

nm23-H1在正常对照组中转染前的表达水平为1.00±0.41，转染后为0.16±0.99，转染前后差值为0.84±0.39(t=6.513，P<0.05)，差异有统计学意义。在EMs组中转染前为1.00±0.75，转染后为0.27±0.27，转染前后差值为0.73±0.53(t=4.312，P<0.05)，差异有统计学意义。表明在间质细胞中nm23-H1经过转染后其相对表达量均有所减少。

β-catenin在正常对照组中转染前后的表达水平为1.00±0.75和5.98±3.36，差值为4.98±2.78，t=5.382，P<0.05，差异有统计学意义。在EMs组中转染前后表达量为1.00±0.49和 9.95±6.48，差值为8.96±6.13，t=4.618，P<0.05，差异有统计学意义。表明间质细胞中β-catenin经过nm23-H1的siRNA转染后表达量均增多(见表1)。

nm23-H1和β-catenin基因在正常组中转染前的表达水平分别为1.00±0.41和1.00±0.75，转染后为0.16±0.99和5.98±3.36，正常组中nm23-H1、β-catenin在转染前后的表达差异有统计学意义(t=6.513，P<0.05，t=5.382，P<0.05)，见表1。

nm23-H1和β-catenin在EMs组转染前的表达水平分别为1.00±0.75和1.00±0.49，转染后为0.27±0.27和9.95±6.48，EMs组中nm23-H1、β-catenin在转染前后的表达差异均有统计学意义(t=4.312，P<0.05；t=4.618，P<0.05)，见表1。

图1 荧光倒置显微镜下观察转染后的细胞

表1 基因在EMs组和正常组中经转染前后的表达

指标组别转染前转染后d±sd配对tPnm23-H1正常组1.00±0.410.16±0.990.84±0.396.5130.000EMs组1.00±0.750.27±0.270.73±0.534.3120.002β-catenin正常组1.00±0.755.98±3.364.98±2.785.3820.001EMs组1.00±0.499.95±6.488.96±6.134.6180.001

3 讨论

nm23基因是广谱的抑癌基因，可调控细胞的生理学行为，在多种肿瘤中发挥着重要的功能[7]。本实验室前期在组织层次上研究nm23-H1在EMs组和正常对照组中表达的差异[8]，收集42例EMs标本和47例正常子宫内膜标本，通过三种研究方法即荧光定量PCR、Western Block、激光捕获腺上皮采用微量提取RNA行荧光定量PCR，结果显示EMs组中nm23-H1的mRNA和蛋白的表达水平均较正常组表达降低，验证了nm23-H1可抑制子宫内膜的转移。本实验主要是在细胞层次上，通过培养原代间质细胞，观察到nm23-H1的表达较正常组降低，与前期组织层次的相关实验的结果一致，且两组细胞经过转染后nm23-H1的表达均下调。由此可知，nm23-H1基因的下调促进了子宫内膜异位症的发生。

β-catenin使细胞迁移、种植，并维持其稳定性，其异常表达使细胞过度增殖，提高上皮间质化(EMT)的相关标记基因的表达[9]。有研究发现EMs组上皮细胞中β-catenin的相对表达量比正常内膜和EMs在位内膜中表达显著增多[10]，说明β-catenin可促使子宫内膜细胞易于从正常位置转移到子宫体外，于子宫体外种植，形成EMs病灶。本实验结果EMs组间质细胞的β-catenin较正常组明显增加，与先前相关报道一致，验证了β-catenin的表达增加可促进EMs的发生。

Che等[11]发现，在肺癌细胞株中，经过nm23-H1的siRNA转染，增加了β-catenin、TIMP-1等基因的表达，减少MMP-2，VEGF和CD44等基因的表达，说明nm23-H1与β-catenin彼此之间存在一定的联系。本实验中间质细胞经过转染后，nm23-H1表达减少，β-catenin表达有所增加，即抑制nm23-H1基因，β-catenin的表达发生变化，且呈增加趋势，此结果与上述结果一致，说明β-catenin接受nm23-H1基因的调控，两者相互作用促进子宫内膜异位症的发生。

综上所述，nm23-H1和β-catenin可能在EMs中有重要的作用，nm23-H1在EMs组中表达较正常组少，β-catenin表达增多，且nm23-H1的下调可以促进β-catenin的表达。此为基础性探讨的实验，可继续研究其通路为EMs的靶向治疗提供潜在的目标。