结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠脾组织IL-35 mRNA表达及其意义

李庆登，徐文琴，高云星，汤兴丽，余方流

(皖南医学院 微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)是引起结核病的慢性感染性病原体。2016年WHO年报显示，全球结核病新发病例1040万，死亡病例180万。我国结核疫情也非常严峻[1]。近年来，随着对H37Ra菌株致病能力与相关毒力基因功能逐步阐明，其越来越成为结核病研究中重要的工具菌[2-3]。白细胞介素-35(Interleukin-35，IL-35)属于IL-12家族中的一种负向调节性细胞因子，有EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)和p35两个亚基[4]。研究表明：IL-35主要通过抑制T细胞增殖和分泌而发挥免疫抑制效应[5-6]。目前，结核分枝杆菌作为一种感染性病原体，其感染与免疫机制尚未完全明了。本实验通过结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠，检测在感染及其不同时段的脾组织IL-35mRNA的表达情况，着重分析IL-35对于结核分枝杆菌感染的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6～8周龄)，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。M.tb减毒株由江苏省疾控中心赠送。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(宝日医生物技术(北京)有限公司)。FastStart Essential DNA Green Master试剂盒(罗氏公司)。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 主要仪器 ESCO Class Ⅱ生物安全柜，AB SimpliAmp PCR仪，罗氏LightCycler®96 qPCR仪。

1.3 动物感染

1.3.1 感染方法 接种环挑取培养好的菌落，用生理盐水制成单个菌悬液，调整菌液浓度至1 × 106/mL。采用尾静脉注射方式感染，感染剂量为每只小鼠1 × 105CFU。

1.3.2 一般生理状况 在感染前对小鼠进行标记并测体质量；感染后对小鼠进行一般状况观察：活动状态、饮食、毛发、体质量等。体质量指数=感染后质量/感染前质量×100%；脾脏系数=脾脏质量/小鼠质量×100%。

1.3.3 肺组织活菌计数 处死小鼠后取出其左肺进行研磨，研磨后的匀浆加入本身体积3倍左右的浓度为4%的硫酸溶液混匀静置20 min以去除杂菌。之后将匀浆2000 r/min离心5 min，去除上清，得到沉淀[7]。用1 mL生理盐水混匀后用200目铜网过滤，再加1 mL生理盐水对铜网进行冲洗。将菌液用生理盐水倍比稀释为6个浓度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)，各取100 μL接种于罗氏培养基，37℃培养6周左右观察有无菌落生成。其最终小鼠细菌数计算方法为：

细菌数=菌落数×10×稀释度×2×2。

1.3.4 肺组织病理观察 取小鼠右肺，福尔马林溶液固定24 h后，经脱水、二甲苯浸润透明、浸蜡后包埋。切片后进行HE染色，二甲苯中性树脂封片，在光学显微镜下观察拍照。

1.4 RT-qPCR

1.4.1 设计引物 在Pubmed网站上下载EBI3亚基和P35亚基的mRNA序列，用Primer Premier软件设计qPCR的引物,经Oligo Calc验证合理后交由生工公司合成。EBI3基因上游引物：5′-CATTGCCACTTACAGGCTCG-3′，下游引物：5′-TGCAGTGACATTTAGCATGTAGG-3′，扩增片段长度139 bp。P35基因上游引物：5′-CAATCACGCTACCTCCTCTTTT-3′，下游引物：5′-CAGCAGTGCAGGAATAATGTTTC-3′，扩增片段长度181 bp。内参β-actin 基因上游引物:5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物:5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，扩增片段长度154 bp。

1.4.2 提取总RNA进行逆转录与qPCR 在十字匀浆器中加入Trizol研磨分离好的50 mg脾脏样本，经三氯甲烷和异丙醇抽提，在4℃离心下沉淀出总RNA。分光光度计下测定RNA的浓度与纯度，A260 /A280 比值在 1.8～2.0则认为纯度合格，总RNA溶液在-80℃ 保存备用。根据测得的RNA浓度计算逆转录加入模板量，使用逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(TAKARA)严格按照说明书上操作进行逆转录操作，得到cDNA，置于-20℃备用。qPCR使用ROCHE LightCycler®96扩增仪，反应体系包含2 μL的引物，10 μL 含有所需离子、酶和SYBR的Master预混液，1 μL的cDNA模板和7 μL的PCR级的超纯水，总体积20 μL。PCR程序如下：95℃ 600 s的预孵育，95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 12 s 3步45个循环。产物溶解曲线分析程序为95℃10 s、65℃ 60 s、97℃ 1 s。结果使用相对定量方法分析。

1.5 统计学分析 所有数据以均数±标准差表示，实验结果采用F检验和q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量指数、脾脏脏器系数和细菌计数情况 感染4周后可观察到小鼠毛色干枯，精神萎靡。对外界刺激反应迟钝，饮水饮食量减少。感染8周后小鼠外观枯瘦虚弱，对外界刺激外应微弱。摄食摄水减少。对照组体质量指数高于感染组(P<0.01)，而感染组的脾脏脏器系数高于对照组(P<0.01)，其中感染8周的小鼠脾脏系数高于感染4周的小鼠(P<0.01)。感染8周的小鼠肺部细菌数目高于感染4周的小鼠(P<0.01)，见表 1。

组别体质量指数脾脏脏器系数Log10CFU/Lung对照组1.549±0.090.003048±0.00022-感染4周组1.096±0.06∗0.005638±0.00099∗6.431±0.041感染8周组1.095±0.05∗0.011795±0.00083∗6.655±0.053F134.125345.923111.723P<0.01<0.01<0.01

*q检验：与对照组相比，P<0.01。

2.2 肺组织大体标本 与对照组小鼠相比，感染组小鼠肺部大体标本外观出现较为密集的大小不等的米白色或浅黄色的圆形或不规则形状的颗粒，感染8周组肺组织的颗粒数量更多且出现有融合更大的颗粒(见图 1)。

图1 H37Ra感染后小鼠肺部大体标本外观

2.3 肺组织病理 与对照组小鼠比较，感染4周组小鼠肺部结构遭到明显破坏，有较为明显的红细胞渗出。相较于对照组小鼠，感染8周组小鼠肺部有大量中性粒细胞、淋巴细胞聚集，而且出现大量的单个核细胞浸润。但是在两个感染组中单个核细胞并未见生成明显的朗罕巨细胞，也未见生成典型的结核结节和干酪样坏死(见图 2)。

图2 H37Ra感染后小鼠肺部组织HE染色结果

2.4 qPCR试验 对qPCR结果进行相对定量分析后发现，EBI3 mRNA在感染组的表达高于正常对照组(P<0.01)，其中感染4周组EBI3 mRNA表达水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而感染8周组表达高于正常对照组和感染4周组。P35 mRNA在感染组的表达高于正常对照组(P<0.01)，感染8周组表达水平高于感染4周组(P<0.01)，见表2。

组别EBI3 mRNAP35 mRNA对照组0.873±0.110.724±0.38感染4周组1.600±0.231.792±0.29感染8周组4.638±1.63∗4.744±0.78∗F156.27844.115P<0.01<0.01

*q检验：与对照组和感染4周组相比，P<0.01。

3 讨论

H37Ra相较于H37Rv菌株毒力较弱[3,8]，在长达8周的时间内并未在肺部形成典型的结核病灶，但是在后续的肺部匀浆培养中证实了H37Ra菌株可以在肺部定植存在，肺部的炎性细胞浸润和病理改变也证实了H37Ra菌株导致了感染状态并且刺激了机体产生免疫反应。H37Ra具备了H37Rv的免疫原性，而与BCG相比，H37Ra菌株的免疫原性更为完整[9]，且因致病毒力弱，故用于构建结核分枝杆菌感染的动物模型[3,8]。

本实验考虑到结核感染为慢性感染，且H37Ra菌株致病力相较于结核分枝杆菌标准株H37Rv弱，另一方面也考虑到IL-35分子表达水平升高是一个逐渐的过程。因此将感染时间在现有实验条件允许的情况下尽量延长至8周，且在第4周时进行中期的对比实验来揭示目的分子表达水平的动态变化。

本实验采取尾静脉注射细菌悬液的方式感染小鼠，虽然与人类在自然条件下通过呼吸道感染结核分枝杆菌患病有较大区别，但是血源性的感染可以更好地控制感染效果并且能较准确地控制感染的剂量。通过结果可以证实尾静脉注射的方式确实可以使小鼠处于感染状态并且产生相应的免疫改变。

IL-35是一种负向调控的炎症因子，由iTR35细胞亚群特异性地产生[5]。在有关结核分枝杆菌感染与IL-35的表达相关研究中，多数学者认为:IL-35在结核菌株感染后其表达会呈现不同水平升高[10-12]，同时有少数研究发现：产IL-35细胞的表达与感染模型小鼠的荷菌量呈负相关[13]。在本实验条件下，采用H37Ra菌株感染小鼠后，在4周及8周时间段其脾组织IL-35表达升高，且试验发现感染8周小鼠脾组织IL-35表达更高，但肺部细菌计数显示也更高，笔者认为，结核分枝杆菌为胞内寄生菌，要达到清除细菌需要免疫功能，特别是细胞免疫功能的增强，而IL-35表达的升高，显示了机体免疫功能的抑制，故而细菌在胞内依然增殖。

本实验发现H37Ra菌株感染小鼠相较于正常对照组小鼠脾脏中EBI3和P35 mRNA表达水平升高，并且在感染8周后更高，提示着IL-35表达通过调节机体的免疫功能而参与调控结核分枝杆菌感染过程。至于IL-35表达调控与结核分枝杆菌感染的详尽机制有待后续进一步研究。