糖尿病大鼠心肌梗死后心肌损伤加重与FUNDC1的关系探讨

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糖尿病及其引发的各种慢性并发症严重威胁人类健康[1]。心肌梗死是导致糖尿病病人死亡的重要原因。糖尿病是心肌梗死的独立危险因素，可以加重病人心肌梗死后心肌损伤。有研究表明，自噬在糖尿病及其诱发的心肌梗死等并发症中发挥了重要作用[2]。自噬是机体的一种防御性机制，能减轻各种应激状态下的细胞损伤，维持器官正常功能，而抑制自噬会导致细胞损伤[3-4]。FUNDC1是一种特殊的细胞膜表面蛋白，在细胞缺氧时发生去磷酸化，通过特定结构域与LC3-Ⅱ相互作用而启动自噬，减轻心肌细胞损伤[5]，而敲除小鼠的FUNDC1基因后自噬被抑制，缺血时心肌损伤加重[6]。糖尿病病人心肌梗死后缺血区心肌损伤增强与自噬的关系目前尚不明确。本实验通过建立糖尿病大鼠心肌梗死模型，观察自噬小体数量、去磷酸化FUNDC1和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达的变化，探讨糖尿病大鼠心肌梗死后心肌损伤增强与FUNDC1及其介导的自噬的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁健康雄性SD大鼠60只，2～3月龄，体重200～220 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为假手术组(NS组)、糖尿病+假手术组(DS组)、心肌缺血组(NI组)、糖尿病+心肌缺血组(DI组)，每组15只。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 DS组和DI组参照文献[7]中的方法构建大鼠糖尿病模型。大鼠禁食不禁水10 h后腹腔注射1%链脲佐菌素(批号：S0130，Sigma，美国)60 mg/kg，普通动物饲料喂养72 h后尾静脉采血测量空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出现多饮、多尿、多食和体重减轻，提示建模成功。实验动物同步普通动物饲料喂养8周，期间不进行胰岛素干预，观察其行为表现，定时测量血糖。

1.3 心肌梗死模型建立 术前禁食不禁饮12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg，麻醉后仰卧固定于保温工作台上，连接BL-410生物机能实验系统监测心电图。经颈正中切口暴露气管，T形切口气管插管后连接ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔特生物科技有限公司)机械通气，设置潮气量8～10 mL，通气频率60次/min，吸呼比1∶2。参照文献[8]中的方法，NI组和DI组大鼠经胸骨左缘第4、5肋间沿肋骨切开暴露心脏，用7-0丝线于左心耳下穿过冠状动脉左前降支(LAD)，丝线两端穿过一细硅胶套管，收紧套管并持续固定造成结扎区域缺血，心电图示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼观察结扎区域心肌颜色苍白，表明心肌梗死模型成功。NS组和DS组只穿线不接扎。

1.4 心肌梗死面积测定(TTC染色法) 心肌梗死6 h后每组随机抽取5只大鼠，经股静脉逆行注入1%伊文氏蓝染液3 mL，立即取出心脏，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后，置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min。后将心脏横切为5～6个薄片，每片厚2 mm左右，切片迅速置于2%TTC溶液中，37 ℃恒温孵育15 min，清洗后用4%甲醛溶液固定15 min。可见蓝色为正常组织，暗红色为缺血心肌组织，灰白色为梗死组织。薄片扫描后用ImageProplus5.0图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)分析，测定缺血区梗死体积与缺血区心肌组织体积的百分比，反映心肌梗死体积。

1.5 病理及电镜切片观察 心肌梗死6 h后，随机抽取各组部分心肌组织，经石蜡切片制备、脱蜡、染色、脱水、封片后于400倍光学显微镜下观察心肌组织HE染色病理学结果。剩余5只大鼠部分组织切成1 mm×1 mm×1 mm大小，放入戊二醛磷酸盐和锇酸中固定，经漂洗、脱水、包埋、切片后，经醋酸双养铀与柠檬酸铅双重染色，JEM-2100型透射电镜(×1 500，JEOL公司，日本)下观察心肌超微结构变化。

1.6 FUNDC与LC3-Ⅱ检测 取部分组织采用western-blot法测定FUNDC1和LC3-Ⅱ表达水平。按照蛋白提取试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明，将大鼠心脏组织打碎后加入细胞裂解液，匀浆离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度。根据目的蛋白的分子量配制不同浓度的分离胶与浓缩胶，80 V电压凝胶电泳90 min，转膜后取出膜用TBS漂洗一次，用TBST配制5%脱脂牛奶，室温下摇床封闭1 h，TBST洗涮20 s后分别加入兔抗鼠单克隆去磷酸化FUNDC1抗体(ABclonal，A16318)和 兔抗鼠LC3-Ⅱ抗体(Proteintech，18725-1-AP)，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗5 min×3次后加入HRP的山羊抗兔(1∶2 000，武汉博士德生物工程有限公司)二抗，4 ℃孵育2 h后，TBST漂洗3次，每次5 min。取适量ECL试剂盒(BIO-RAD，1705060)中等体积A液和B液混合，加到目的条带附件避光反应5 min。化学光敏模式曝光显影。以β-actin为内参，以去磷酸化FUNDC1条带灰度值与β-actin条带灰度值之比反映FUNDC1的去磷酸化水平；以LC3-Ⅱ条带灰度值与β-actin条带灰度值之比反映 LC3-Ⅱ的表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比较 与NS组相比，DS组心肌梗死面积差异无统计学意义(P>0.05)，NI组、DI组心肌梗死面积增大(P<0.05)；与DS组相比，NI组、DI组心肌梗死面积增大(P<0.05)；与NI组相比，DI组心肌梗死面积增大(P<0.05)。与NS组相比，DS组FUNDC1去磷酸化差异无统计学意义(P>0.05)，NI组、DI组FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；与DS组相比，NI组、DI组FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；与NI组相比，DI组FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)。与NS组相比，DS组、NI组、DI组LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；与DS组相比，NI组、DI组LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；与NI组相比，DI组LC3-Ⅱ减少(P<0.05)。详见表1、图1、图2。

表1 各组大鼠心肌梗死面积、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比较(±s)

与NS组比较，1)P<0.05；与DS组比较，2)P<0.05；与NI组比较，3)P< 0.05

图1 各组大鼠心肌梗死面积TTC染色结果

图2 各组大鼠心肌组织FUNDC1、LC3-Ⅱ western-blot检测条带

2.2 光镜下观察结果 NS组心肌细胞形态正常，胞质染色均匀，胞核居中，结构完整；DS组心肌纤维排列稍紊乱，胞浆有轻度的肿胀，可见少量炎细胞浸润；NI组细胞形态不规则，心肌纤维排列紊乱或断裂，胞浆有不同程度的肿胀甚至破裂，胞核排列不齐、碎裂和溶解；DI组心肌病理损伤程度较NI组增强，心肌纤维断裂，心肌细胞崩解，细胞核溶解，染色加深，可见大量炎细胞浸润。详见图3。

图3 各组大鼠心肌组织病理切片HE染色(×400)

2.3 电镜下观察结果 NS组心肌纤维排列规整，线粒体结构清晰，形态较规整，嵴密集；DS组肌纤维排列较为整齐，部线粒体出现形态变化、分嵴数量减少或断裂；NI组肌丝排列紊乱，线粒体结构破坏，嵴减少，并可见大量的自噬小体；DI组心肌细胞损伤明显加重，肌丝溶解，随处可见线粒体分裂，嵴断裂溶解，自噬小体数量减少。详见图4。

图4各组大鼠心肌组织透射电镜切片观察

3 讨 论

本研究参照文献[7]方法，禁食不禁水10 h后腹腔注射1%链脲佐菌素60 mg/kg建立大鼠糖尿病模型，给药72 h后测量空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出现多饮、多尿、多食和体重减轻，提示模型建立成功。同时参照文献[8]的方法，结扎冠状动脉左前降支，结扎后心电图显示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼观察结扎区域心肌组织颜色苍白，TTC染色发现心肌梗死面积增大，病理学与超微结构损伤加重，提示大鼠心肌梗死模型制备成功。

急性心肌梗死是引起糖尿病病人死亡的重要原因，糖尿病病人对心肌缺血性损伤的易感性增加。糖尿病病人体内存在糖和脂质代谢异常、氧化应激、糖基化产物堆积等众多因素可以引起心肌结构和功能破坏，使得心肌在应对缺血缺氧时适应性代偿反应减弱，损伤加重。近年来的研究表明，自噬在急性心肌梗死等缺血性心脏疾病中发挥了重要保护作用，能够减少由心肌缺血引起的细胞死亡[9]；抑制自噬会导致心肌梗死后的缺血性损伤加重[10]。FUNDC1是缺氧诱发线粒体自噬所必需的一种新的线粒体相关膜蛋白[11]，普遍表达于哺乳动物体内，尤其是心脏。正常情况下酪氨酸激酶(SRC)可以通过促使FUNDC1磷酸化而不介导自噬发生。当心肌梗死发生时，梗死血管供血区缺血缺氧，SRC失活导致FUNDC1发生去磷酸化，去磷酸化FUNDC1对LC3-Ⅱ有更强的亲和力，能通过特定的结构域募集LC3-Ⅱ并且发生相互作用而介导自噬[5]，对抗营养物质缺乏、应激状态等不利因素产生的影响。本研究结果表明，与NS组比较，NI组自噬小体数目增加，去磷酸化的FUNDC1增多，LC3-Ⅱ表达增强(P<0.05)，提示FUNDC1参与了心肌细胞自噬以对抗梗死后心肌缺血性损伤。

糖尿病心肌细胞自噬的启动和发展是一个复杂的过程。研究表明，胰岛素可以作为信号通过激活PI3K-Akt/PKB-mTOR通路抑制自噬的发生[12]。但糖尿病病人存在胰岛素分泌不足或抵抗，自噬可能被激活。糖尿病病人体内的高血糖、脂质代谢异常、氧化应激、钙离子超载、各种炎症介质、胰岛素样物质等因素也可以作用于自噬，发挥激活或者抑制自噬的作用[13]。本实验结果显示，与NS组相比，DS组自噬小体数目增加，LC3-Ⅱ表达升高(P<0.05)，证明在糖尿病病人心肌细胞自噬水平升高。糖尿病病人心肌细胞表现出这种自噬状态是各种激活和抑制因素共同作用的净效应。

FUNDC1是缺氧诱导自噬的关键蛋白。Zhang等[6]通过敲除小鼠的FUNDC1基因，发现心肌缺血时缺血区自噬受到抑制，心肌损伤加重。本研究显示，与NI组相比，DI组大鼠病理学与超微结构损伤加重，梗死面积增大，自噬小体数目减少，去磷酸化的FUNDC1减少，同时LC3-Ⅱ表达下调(P<0.05)，提示糖尿病大鼠心肌梗死后心肌损伤加重可能与梗死区心肌细胞去磷酸化的FUNDC1减少，自噬水平降低有关。有研究提示，糖尿病大鼠体内过表达的BCL-x可能是心肌梗死时心肌细胞FUNDC1去磷酸化减少的原因[14-16]，但具体的机制尚不明确，有待更进一步研究。综上所述，糖尿病大鼠心肌梗死后心肌损伤加重可能与糖尿病抑制了梗死区心肌细胞FUNDC1去磷酸化有关。