双参通脉颗粒对大鼠心肌细胞凋亡的干预作用

2019-04-17，，，

中西医结合心脑血管病杂志 2019年5期

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细胞凋亡作为细胞死亡的两种表现形式之一，又称为程序性细胞死亡，近年来大量研究表明急性心肌缺血后的心肌细胞中存在细胞凋亡[1]。P-JAK2在多种细胞外信号刺激下激活，激活的 JAK使 STAT3 磷酸化而被活化，移位到细胞核中，启动相应基因表达，抑制细胞凋亡[2]。中药双参通脉颗粒具有益气养阴、活血通络的功效。本研究采用双参通脉颗粒干预大鼠急性心肌缺血模型，从而探讨其对心肌细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康雄性SD大鼠共60只，250～280 g。来源于辽宁中医药大学实验动物中心，于清洁级环境内饲养 7 d。

1.1.2 实验药物双参通脉颗粒，主要组成：人参、黄芪、麦冬、当归、丹参、川芎，采用传统颗粒制备方法，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。盐酸地尔硫卓片由天津田边制药有限公司生产，每片30 mg，国药准字：H12020126。

1.1.3 主要试剂与仪器原位末端转移酶标记技术(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物科技发展有限公司 KGA702)；DAB Kit(福州迈新生物科技有限公司 DAB-1031)；苏木素染色液(南京建成生物工程研究所 D005)；4%多聚甲醛、蛋白酶 K、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(上海前尘生物科技公司)等。

高速台式离心机(德国Eppdendorf 公司)；MP150 多导生理信号采集系统(德国 Leica 公司)；BB23 型培养箱(美国 PE 公司)；ROTEAN 电泳系统(美国 Bio 公司)；冰冻切片机OM3123 型(瑞典 Bio 公司)；恒温恒湿箱(上海科技生物公司)；多功能酶标仪(美国 Cell Signaling 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 造模方法对实验动物进行造模，复制急性心肌缺血模型。取大鼠称重，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，于腹腔麻醉成功后将大鼠仰卧位固定于手术台上，气管切开，呼吸机辅助呼吸(频率 85 次/min，潮气量 18 mL，呼吸比1∶1)，连接心电检测仪，术中记录Ⅱ导联心电图。于左冠状动脉前降支起始下2 mm处结扎，正常组不结扎，检查无出血，抽出胸腔积气积液，拔出引流管，逐层关闭胸腔。

1.2.2 实验分组及给药方法健康SD大鼠共60只，随机分为6组：假手术组、模型组、西药组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，造模死亡率为20%，故剩余48例，每组8只。按人和动物等效剂量换算法折算大鼠剂量进行换算，正常组及模型组予生理盐水3 mL灌胃，每日2 次；西药组予以盐酸地尔硫卓片灌胃，剂量为4.23 mg/kg；中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组予双参通脉颗粒灌胃，分别相当于生药量37.5g/(kg·d)、18.75g/(kg·d)、 9.37 g/(kg·d)，均制成 6 mL，每次3 mL，每日2 次，疗程2周。

1.2.3 观察心肌组织病理变化取连续心肌组织2块，厚度2～3 mm，将标本固定于4%多聚甲醛中，观察各级乙醇脱水，石蜡固定进行常规切片，按常规方法进行脱蜡，水合，再于二甲苯、各级乙醇中脱水，抗原修复，抗原-抗体反应，苏木精-伊红(HE)复染，二甲苯透明、滤纸吸干、中性树胶封片，光镜下观察左心室组织学改变。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡取心肌组织石蜡包埋、切片、脱水、蛋白酶孵育，加入 TUNEL 反应液，于37 ℃下静置 1 h，加 DAB 苏木素复染，PBS洗涤，梯度酒精脱水，二甲苯透明、封片。显微镜下正常心肌细胞核蓝色，凋亡细胞核为棕褐色。每张切片于相同区域选取5个高倍视野计数，其中所占总细胞数百分比即为凋亡指数。

1.2.5 P-JAK2蛋白表达取缺血心肌组织数块，提取蛋白，进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳。采用Western Blot方法测定心肌细胞中的P-JAK2蛋白表达。

2 结果

2.1 心肌组织病理变化假手术组：心肌细胞排列紧密，无明显水肿，肌纤维未见明显扭曲，细胞膜完整，细胞核居中，无明显炎症浸润；模型组：心肌细胞水肿，组织间隙增宽，肌纤维扭曲、紊乱，炎细胞浸润，大量红细胞存在于细胞间隙，细胞核散乱分布；西药组：与模型组比较，心肌细胞水肿明显好转，肌纤维断裂现象较少，炎细胞浸润，红细胞渗出；中药低剂量组：与模型组比较，心肌细胞水肿减轻，细胞边界清晰，存在出血，红细胞渗出较多；中药中剂量组：心肌细胞排列尚规整，与模型组比较，心肌细胞水肿区域较小，肌纤维无明显断裂，炎症浸润不明显；中药高剂量组：与模型组比较，心肌细胞水肿显著减轻，细胞边界轮廓清晰，组织间隙有轻微水肿，肌纤维无断裂，红细胞渗出较少。详见图1。

2.2 心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡指数：假手术组心肌组织未见明显凋亡的细胞；模型组心肌组织中凋亡细胞较多、较密集；西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组凋亡细胞均较模型组减少。详见图2。

2.3 各种心肌细胞中P-JAK2蛋白表达与假手术组比较，模型组P-JAK2蛋白表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药低剂量组及中药高剂量组P-JAK2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)，西药组、中药中剂量组P-JAK2表达有升高趋势，差异无统计学意义(P>0.05)；中药高剂量组与西药组、中药低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图 3。

3 讨论

中药双参通脉颗粒由人参、黄芪、麦冬、当归、丹参、川芎6味药物组成，方中人参大补元气，黄芪补气健脾，麦冬益胃生津，当归活血养血，丹参活血止痛，川芎行气活血，全方通补兼施，共奏益气养阴、活血通络之功。现代药理研究表明，人参所含有的总皂甙可以抑制细胞凋亡，其作用机制可涉及多个细胞信号传导通路[3]。黄芪具有增强心肌收缩力、扩张冠状动脉、保护心肌细胞、改善心脏功能等作用[4]。麦冬提取物及皂苷等成分，具有抗心肌缺血、保护心肌、抗炎等作用[5]。当归所含有机酸有抗心肌缺血、保护线粒体等作用[6]。丹参具有抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞、改善微循环等作用[7]。川芎主要成分川芎嗪，具有血管平滑肌解痉作用，并能保护线粒体，对心血管系统有强大活性[8]。双参通脉颗粒诸药合用，能够抗心肌缺血、减轻心肌细胞氧化损伤，随着中医药研究的不断深入，其干预心肌细胞凋亡的机制将被进一步阐明。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，作为细胞死亡形式的一种，目前研究表明，缺血损伤可激活 JAK2/STAT3 信号通路，减少P-JAK2和P-STAT3的表达，诱发心肌细胞凋亡[9]。P-JAK2作为细胞凋亡的抑制因子，能降低心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤[10]。而使用 JAK2 特异性阻断剂 AG490，能取消该通路的心肌保护作用[11]。有学者发现，姜黄素等药物预处理诱导大鼠的心肌保护作用，均通过诱导心肌 JAK2和STAT3 的磷酸化，减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡[12]。本研究通过测定P-JAK2蛋白表达来观察中药双参通脉颗粒对心肌细胞凋亡的影响。