替米沙坦对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

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尽管在冠状动脉粥样硬化心脏病的预防和治疗方面取得了很大的进展，但仍有很高比例的病人在急性冠状动脉事件中突然死亡[1]。研究表明，冠状动脉粥样硬化斑块的破裂和随后的血栓形成占急性冠状动脉事件的70%。易于破裂的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块被称为易损斑块[2]，因此，稳定易损斑块是冠心病治疗的重点。临床研究显示，不管是通过血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类或是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)类药物抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)都可以减少冠心病病人的发病率和死亡率[3]。并且实验研究证实，ACEI类或是ARB类药物都可以抑制动脉硬化病变[4]。但其是否可以稳定动脉粥样硬化斑块，相关研究有限。因此，本研究的目的是确定替米沙坦是否具有稳定动脉粥样硬化易损斑块的作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6～8周龄载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠[品系C57BL/6J，购自北京大学医学部实验动物中心(美国Jackson实验室引进并培育)]32只，雌雄各半，体重18～20 g。

1.1.2 药物及配制 替米沙坦商品名美卡素，由上海勃林格殷格翰药业有限公司生产，批号为J20090089。阿托伐他汀商品名立普妥，由辉瑞制药有限公司生产，批号为H20051409。

1.1.3 试剂与仪器 抗鼠平滑肌细胞α肌动蛋白(SMα-actin)购自Neo Markers公司。二步法免疫组化检测试剂(鼠兔共用通用型二抗)购自DaKo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立、分组及给药 基础饲料喂养6～8周后，给小鼠饲以含脂肪21%、胆固醇0.15%的高脂饲料[5](60Coγ灭菌照射处理)13周。确定AS形成后，将小鼠随机分为3组：替米沙坦组、阿托伐他汀组、对照组，各10只。按成人与小鼠的给药剂量换算系数折算成小鼠用量[6]：替米沙坦组12.01 mg/(kg·d)，阿托伐他汀组3 mg/(kg·d)，对照组(蒸馏水)。将药物溶于蒸馏水中，灌胃给药，每日1次，继续喂养13周。

1.2.2 标本处理 给药治疗13周后处死全部小鼠，游离主动脉，沿中线纵向切开用于观察大体病理标本，大体标本进行苏丹Ⅳ染色。取出心脏，10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，小鼠心底部横断面连续切片。按Suzuki等[7]的方法，每只小鼠主动脉根部取3个相同的切面，分别是：①升主动脉最近端横截面；②主动脉瓣起始横截面；③主动脉瓣完全出现并汇合在一起。每只小鼠各取上述3个切面的切片分别进行HE染色、Movat染色和免疫组化染色，光镜下观察。每个样本的所用形态学观察指标的计算均取3个切面的平均值进行较全面的综合评价。

1.2.3 病理染色

1.2.3.1 HE染色 HE染色主要观察斑块内细胞外脂质(extracellular lipids，EL)成分(主要是胆固醇结晶和胆固醇酯)。

1.2.3.2 Movat五色套染法 采用改良的Movat五色套染法[8]，染色结果为：细胞核及弹力纤维为黑色；基质和黏蛋白为蓝色；胶原纤维为黄色；平滑肌为红色；泡沫细胞(foam cells，FC)为淡紫色。主要观察斑块内泡沫细胞、胶原成分。

1.2.3.3 免疫组化染色 免疫组化染色检测主动脉根部动脉粥样斑块内SMα-actin。采用Envision两步法免疫组化染色，切片脱蜡，0.3%H2O2室温15 min灭活内源性过氧化物酶；滴加一抗(1∶300稀释)4 ℃过夜；滴加通用型二抗，室温孵育1～2 h；TAB显色。

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 大体标本 将染色后的大体标本在放大6倍的体视显微镜下拍照，并使用图像分析软件(Image-ProPlus 5.1)测量血管内膜上的斑块面积和内膜总面积，并计算斑块/内膜面积的比值。

1.2.4.2 主动脉根部横切片 切片在×40倍普通光镜下，利用病理组织实时摄像显微镜系统摄像。采用图像分析软件测量每个切片的管腔面积和内弹力膜围绕面积，后者减去前者即为动脉粥样硬化斑块面积。校正后斑块面积即斑块面积除以内弹力膜围绕面积。同时采用该软件测量并计算细胞外脂质、泡沫细胞、胶原面积(collagen area，CA)成分各自占斑块面积的百分比，并结合免疫组化染色测量斑块内平滑肌细胞(SMC)阳性面积占斑块面积的百分比，最后采用易损指数(vulnerablility index，VI)[9]综合评价药物对小鼠主动脉斑块稳定性的影响。每个样本取3个切面的平均值。计算公式为：VI=(EL+FC)/(CA+SMC)，每个样本取上述指定的3个切面的平均值。

1.2.4.3 血脂测定 于实验结束时采血，采血前12 h禁食水，眶下静脉取血，离心分离血清。总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride， TG)用酶法测定，高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)用免疫比浊法测定。

2 结 果

2.1 病理观察

2.1.1 大体标本 各组小鼠主动脉管壁均明显增厚、粗糙，管壁上可见一些红染呈斑块样突起，大小不等，散在或融合成片，详见图1。干预后，替米沙坦组及阿托伐他汀组小鼠主动脉斑块/内膜面积比值分别为28%、22%，均明显低于对照组的36%，差异有统计学意义(P<0.05)，提示经过药物干预后粥样硬化病变累及范围有所降低；但替米沙坦组和阿托伐他汀组之间差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图1 ApoE基因敲除小鼠主动脉大体标本(苏丹Ⅵ染色)

与对照组比较，＊ P<0.05图2 各组ApoE基因敲除小鼠主动脉大体标本斑块面积的比较

2.1.2 HE染色和Movat五色套染法观察斑块内部成分 如图1、图3～图6所示，光镜下对照组及各药物干预组小鼠主动脉根部可见明显的动脉粥样硬化斑块，显示出易损斑块特征。Movat五色套染法染色后，光镜下模型组及各药物干预组小鼠主动脉根部内皮细胞下可见淡紫色泡沫细胞，斑块纤维帽被泡沫细胞覆盖，弹力纤维变性、断裂、变薄、甚至消失，血管三层结构破坏。对于主动脉根部横切面动脉粥样硬化斑块面积，替米沙坦组与对照组比较差异无统计学意义，阿托伐他汀组较对照组减少了23%(P<0.05)，但校正后斑块面积各组之间差异无统计学意义，详见图7、图8。

图3 ApoE基因敲除小鼠主动脉根部横切面HE染色(×10)

图4 ApoE基因敲除小鼠主动脉根部横切面HE染色(×40)

图5 ApoE基因敲除小鼠主动脉根部横切面Movat染色(×40)

图6 ApoE基因敲除小鼠主动脉根部横切面平滑肌免疫组化染色(×40)

与对照组比较，＊ P<0.05图7 各组ApoE基因敲除小鼠主动脉根部横切面斑块面积比较

图8 各组ApoE基因敲除小鼠校正后主动脉根部横切面斑块面积比较

2.2 主动脉斑块内部成分改善情况 给药13周后，替米沙坦组和阿托伐他汀组小鼠动脉斑块易损指数分别为1.12和0.91，均低于对照组的2.67(P<0.05)。

详见图9、图10。

与对照组比较，＊P<0.05，#P<0.01图9 各组ApoE基因敲除小鼠主动脉斑块成分所占面积比较

与对照组比较，＊P<0.05图10 各组ApoE基因敲除小鼠易损指数比较

2.3 血脂的测定 与对照组比较，阿托伐他汀组TC和LDL-C水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组ApoE基因敲除小鼠血脂水平比较(±s) mmol/L

与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

一些临床研究显示，ARB或ACEI类药物不仅能够降低血压，同时能够减少病人心血管事件，并且与药物本身的降压作用无关[10-12]。这是因为RAS系统在动脉粥样硬化斑块形成和发展中起着重要作用，因此ARB类药物作为抗动脉粥样硬化药得到了广泛应用[13-14]。目前的研究表明，斑块的稳定性主要取决于斑块内组织成分以及纤维帽的状态[14]。纤维帽主要是由平滑肌细胞和胶原构成[14]。而巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)和γ-干扰素，最终使斑块纤维帽变薄，易于破裂[15]。因此，将脂质成分(泡沫细胞和细胞外脂质)与纤维肌性成分(平滑肌细胞和胶原纤维)共同作为衡量斑块的易损指数[9]，可作为反映斑块易损性的更为客观、全面的评价指标。本研究结果表明，与对照组相比，替米沙坦组及阿托伐他汀组小鼠主动脉斑块易损指数均显著降低(P<0.05)。替米沙坦组可降低泡沫细胞含量，增加胶原和平滑肌，使得易损指数下降。阿托伐他汀组可降低细胞外脂质，增加胶原和平滑肌，也使易损指数下降。因此，替米沙坦和阿托伐他汀都可以稳定动脉粥样硬化斑块。

根据本实验结果，替米沙坦对血脂水平和细胞外脂质面积的影响并不显著，但可以明显减少泡沫细胞。泡沫细胞来源于巨噬细胞，巨噬细胞通过内吞低密度脂蛋白转化成泡沫细胞。研究显示巨噬细胞在动脉粥样硬化的所有阶段都具有重要功能，包括斑块破裂的过程。因此，推测替米沙坦促进斑块稳定性的可能机制是抑制动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞。这与目前的研究结果相一致，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活后血管紧张素作用于血管壁AT1受体从而促进动脉粥样硬化的发生和发展，在动脉粥样硬化时AT1受体表达增多并通过单核细胞趋化蛋白促进单核/巨噬细胞聚集，还可促进平滑肌细胞移行和增殖而参与动脉粥样硬化的发展[16]。而替米沙坦作为一种高选择性AT1受体拮抗剂，可减少单核/巨噬细胞的聚集，提示其在延缓或稳定动脉粥样硬化斑块方面有重要作用。

综上所述，本研究表明，使用替米沙坦可以有效地延缓动脉粥样硬化的进展，并通过改变斑块的组成促进ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的稳定性。在此基础上，深入研究替米沙坦稳定动脉粥样硬化易损斑块的机制，对于进一步提高稳定斑块作用，减少临床急性心血管事件的发生具有重要意义。