新型姜黄素纳米胶束丝素凝胶的制备及其质量表征

钟松阳，郑宏亮，毛凯丽，王思为

（衢州市人民医院 药剂科，浙江 衢州 324000）

姜黄素（curcumin，CUR）是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种低分子疏水性多元酚化合物，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤等作用，主要作为食用色素使用。近年来研究发现姜黄素能诱导人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）凋亡，抑制TNF-α诱导的NF-κB的激活，并减少炎症因子IL-6和IL-8的分泌，从而对抗银屑病中TNF-α，具有明显的抗银屑病作用[1-2]。但是由于姜黄素溶解度低同时理化性质不稳定导致传统口服给药药物难吸收、生物利用度低。皮肤外用药物穿透性差，只能滞留在角质层，限制了其在抗银屑病等慢性皮肤炎症上的应用。纳米药物载体在递送药物至表皮、真皮提高治疗部位药物浓度、减小全身不良反应方面，具有明显的优势[3-5]。本研究在前期研究基础上创新性地将穿透性纳米技术和丝素凝胶技术相结合，应用自主合成的新材料两亲性维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）-接枝-（ε-多聚赖氨酸，polylysine，PLL）（VES-g-PLL）聚合物[6]为膜材制备包载姜黄素的纳米胶束（curcumin-loaded nanomicelles，CUR-NMs），提高药物稳定性、水溶性，改善其皮肤穿透性，继以丝素凝胶为基质分散纳米颗粒，延长药物在皮肤等局部组织的滞留时间，制备成包载姜黄素的纳米胶束丝素凝胶（CURNMs-gel），并对其相关质量指标进行表征，为银屑病的药物治疗提供新方式。

1 材料和方法

1.1 材料 姜黄素购自上海阿拉丁公司，VES-g-PLL聚合物由实验室前期合成，水合氯醛购自德国BASF公司，氯倍他索（氯倍他索软膏0.1%）购自英国葛兰素史克制药有限公司，健康雄性BALB/c小鼠（8～11周）购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 方法

1.2.1 姜黄素载药纳米胶束的制备：称取适量姜黄素以及VES-g-PLL聚合物，预先共溶于一定体积的二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）溶液中，在剧烈搅拌下，将上述DMF溶液缓慢滴入至去离子水中自发组装，在室温、避光条件下搅拌过夜，将组装纳米粒转移至透析袋（截留相对分子质量3600 Da）内，用蒸馏水透析、离心，除去未包裹的游离药物以及有机溶剂，制备载姜黄素纳米胶束（CUR-NMs）。空白纳米胶束（Bk-NMs）制备方法同上。

1.2.2 粒径、Zeta电位和形态表征：粒径、Zeta电位：聚合物纳米粒水溶液，过0.8 μm膜，经适当稀释后，于常温条件下固定激光波长为632.8 nm、散射角90°，NICOMPTM 380粒度测定仪测定粒径和Zeta电位。应用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察载体的微观形态：取上述纳米胶束100 μL滴于铜网上有碳膜的一面，以无纤维滤纸从铜网边缘吸掉多余液体，待完全干燥后，滴入1滴2%磷钨酸至载有纳米粒的铜网上，滤纸吸掉边缘多余液体，室温染色，放置自然晾干2 d，置于透射电镜中以100 kV加速电压检视。

1.2.3 载药量及包封率测定：取0.5 mL载药纳米胶束溶液，置10 mL容量瓶中，加入乙腈、超声破坏纳米结构、稀释，0.8 μm微孔滤膜过滤，续滤液10 μL进HPLC分析。HPLC条件：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为：甲醇/3 mmol/L磷酸二氢钾/0.5%醋酸（58∶42∶0.5）；流速1.0 mL/min，检测波长为227 nm。按照下列公式计算载药量及包封率：载药量（%）=[测得药物重量/（测得药物重量+载体材料重量）]×100%；包封率（%）=（测得药物重量/制备时加入药物）×100%。

1.2.4 姜黄素丝素纳米凝胶的制备：蚕茧先在1.5%碳酸钠溶液中煮沸30 min，然后用蒸馏水清洗去除杂质。洗净的丝素蛋白在9.3 mol/L溴化锂溶液60 ℃条件下充分溶解2 h。再把丝素蛋白溶液在透析袋中用蒸馏水透析72 h。最终得到的丝素蛋白溶液浓度约在2%。取制备好的丝素蛋白溶液和CURNMs溶液按体积比1∶1混合，然后用细胞破碎仪超声（功率50 W）混合溶液1 min得到CUR-NMs-gel。

1.2.5 载药及空白丝素纳米凝胶微观形态测定：应用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察载药及空白丝素纳米凝胶的表面微观形态、三维结构。

1.2.6 载药纳米胶束凝胶的体外释放度测定：应用动态法测定CUR-NMs及CUR-NMs-gel的体外药物释放度，过程简述如下[6]：将1 mL CUR-NMs溶液或CUR-NMs-gel加入到透析袋中（截留相对分子质量3500 Da）。然后将透析袋放入10 mL释放介质（0.5%吐温80，pH=7.4 PBS溶液）中，在37 ℃，120 r/min搅拌条件下进行释放试验。每个时间点抽取定量释放介质，应用上述HPLC法测定药物浓度并及时补充空白释放介质。

1.2.7 载药纳米胶束凝胶在体皮肤渗透实验：取健康雄性小鼠，随机分成2组，除去背部皮肤上的毛发，选取1 cm2添加姜黄素溶液丝素凝胶（CUR-gel）或CUR-NMs-ge（l500 μg姜黄素）。分别于24 h及48 h后断颈处死小鼠，剥离背部皮肤后，用0.9%氯化钠溶液反复冲洗干净，冰冻切片成5 μm厚切片，苯基吲哚染色7 min后激光共聚焦显微镜下观察载药纳米胶束的皮肤渗透深度。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。计数资料用±s表示，2组间比较采用成组t检验，多组间数据比较用单因素方差分析，两两比较用SNK法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载药纳米胶束质量表征 载药前后纳米胶束的微观形态无明显变化，空白及载药纳米胶束都呈标准的椭球形，分散性均匀，粘连少。粒径及Zeta电位检测结果显示：空白和载药纳米胶束的平均粒径分别为（25.23±5.92）nm和（31.14±7.86）nm，而Zeta电位分别为（19.60±1.53）mV和（16.70±1.45）mV，均＞15 mV。制备的载药纳米胶束的包封率及载药量分别为82.21%±4.32%和3.51%±0.29%。空白及载药纳米胶束的TEM结果见图1。

2.2 载药及空白纳米胶束丝素凝胶的微观形态测定结果 未载药的空白丝素凝胶由许多海绵样的结构组成，各个海绵样结构连接在一起形成了丝素凝胶内部的3D网状结构。而CUR-NMs-gel SEM显示，CUR-NMs作为一种纤维絮状物均匀黏附于丝素3D网状结构的表面，从而起到药物持续释放的效果。见图2。

2.3 CUR-NMs和CUR-NMs-gel的体外药物释放度测定 不管是CUR-NMs还是CUR-NMs-gel都没有明显的药物突释现象。在72 h及pH=7.4的PBS溶液中，大约30%的药物从载药纳米胶束丝素凝胶中释放，而大约有49%的药物从载药纳米胶束释放，CUR-NMsgel及CUR-NMs体外药物释放度测定结果见图3。

2.4 CUR-NMs-gel在体皮肤渗透 在激光共聚焦显微镜下姜黄素显绿色荧光而细胞核显蓝色荧光。在药物作用24 h后CUR-gel组小鼠皮肤角质层出现较明显的绿色荧光，而CUR-NMs-gel组小鼠皮肤角质层绿色荧光较弱，大部分药物还停留在皮肤表面。72 h后，CUR-gel组绿色荧光仍旧停留在皮肤角质层，几乎不向深层皮肤渗透；而CUR-NMs-gel组小鼠皮肤72 h后各层皮肤包括角质层、上皮层及真皮层都有绿色荧光信号，且信号分布较均匀。各组大鼠载药纳米胶束凝胶在体透皮实验结果见图4。

图424和48 h后CUR-gel组和CUR-NMs-gel组中CUR在小鼠皮肤中的渗透情况（×200）

3 讨论

姜黄素是从姜料等植物的根茎部位提取出的一类二酮类化合物，具有良好的抗炎作用，对于银屑病等慢性皮肤炎症疾病具有较好的治疗效果[8]。但是其本身存在药物溶解度低、口服难吸收，皮肤给药药物穿透性差等缺陷，使得传统的给药剂型和药物递送载体并不能满足临床需要。本次实验在前期研究基础上应用自主合成的新材料VES-g-PLL聚合物作为纳米胶束的膜材[9]。该聚合物能自发在水中组装成表面带正电荷、粒径在10～100 nm之间的纳米胶束，可用于疏水性药物姜黄素的包载，提高药物稳定性、水溶性，改善皮肤穿透性。载药纳米胶束的质量表征结果显示：本研究制备的载药及空白纳米胶束的平均粒径均＜50 nm，Zeta电位均为正值且绝对值均大于15 mV，说明本研究制备的空白及载药纳米胶束稳定性好，不易粘连[7]。已有研究证实：表面带正电荷且粒径分布在10～100 nm，尤其是粒径在50 nm以下的纳米颗粒能够显著促进药物的皮肤渗透[10-11]。同时包封率测定及体外释放试验结果显示，本次研究制备的载药纳米胶束的包封率高达82.21%±4.32%，且体外释药平稳，无药物突释现象；载药量为3.51%±0.29%，包封率及载药量是评价纳米载体性能的重要指标，说明应用新材料制备的纳米胶束对于难溶性药物姜黄素具有较好的载药能力，可以实现对药物的高包封。因此本研究应用新材料制备的纳米胶束能够较好地实现对于姜黄素的包载，增加其皮肤渗透能力。

为了进一步增加载药纳米颗粒的缓释作用同时延长纳米载体在皮肤的停留时间，本研究还将载药纳米胶束分散到丝素水凝胶中。丝素凝胶是指利用丝素蛋白的物理性质形成凝胶，它可以有效地增加药物的有效负载，延长药物在皮肤的滞留时间，在人体内产生控释、缓释、靶向、降低毒性等特点；可实现长期释药，广泛应用于皮肤局部给药、眼部给药、鼻部给药、直肠给药以及注射给药，在药学领域中发挥着重要的作用[12-14]。本研究将载药纳米胶束进一步与丝素蛋白水凝胶混合制备CUR-NMsgel。CUR-NMs-gel的SEM观察结果可以证实：载药纳米胶束以絮状物形式黏附于丝素蛋白的3D网状结构表面（这可能是由于载药纳米胶束带正电荷而丝素纤维蛋白带负电荷二者产生静电吸附作用），从而使得载药纳米胶束吸附于丝素凝胶的网状结构表面，从而起到更好的药物缓释效果。载药纳米胶束及其水凝胶的体外释药实验也证实，相比于单纯的纳米胶束包载，应用丝素水凝胶结合纳米胶束能够进一步实现姜黄素的缓释效果。另外本研究还考察了载药纳米胶束丝素凝胶的在体皮肤渗透试验，结果证实：单纯的姜黄素溶液与丝素凝胶混合只能将药物渗透到皮肤的角质层，而应用载药纳米胶束结合丝素凝胶能够将药物递送到皮肤各个层面包括角质层、上皮层及真皮层，从而发挥药物治疗效果。

综上所述，应用新材料VES-g-PLL制备的载药纳米胶束结合丝素凝胶能够实现难溶性药物姜黄素的缓释及透皮吸收，有望成为治疗银屑病等慢性皮肤炎症疾病的一种新方法。