背角无齿蚌AwPrx4A基因克隆及在PFOS和PFOA胁迫下的表达分析

夏西超，张科，宋国英，马向莉，宗玉霞，张明霞，李冰洁，于瑞雪，薛士鹏，刘庆春，华春秀，张庆远

1. 平顶山学院医学院，平顶山 476000 2. 南阳医学高等专科学校基础医学部，南阳 473061

全氟类化合物是一类以4～14个碳原子的烷基链为支架，氢原子被氟原子取代的具有高能C—F键的新型持久性有机污染物[1-2]。目前，全氟类化合物已被广泛应用于粘合剂、农药、阻燃剂、食品包装盒、润滑剂、药品、油漆、抛光剂、制冷剂和表面活性剂的生产过程中[1-2]。日常生活中，大量全氟类化合物从废弃物中释放到自然界中，并随降雨导致地表水和地下水的污染。研究表明，环境中较为常见的是全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)和全氟辛酸(perfluoroocanoic acid, PFOA)，已对水生生物生存造成威胁，给整个水生生态系统带来潜在的压力[3-4]。双壳类软体动物属于滤食性动物，常年居住于固定环境，很少移动和迁徙，易于遭受水体重金属和持久性有机染物的影响，使机体出现氧化应激反应，生成大量活性氧族(ROS)，给生物体造成胁迫[5]。生成过量的ROS能够造成细胞电子传递链功能异常、线粒体出现呼吸爆发、生物大分子结构的破坏。为了减少ROS生成，降低胁迫效应，机体启动抗氧化酶系统的表达[6]。在这些酶中，硫氧化蛋白过氧化物酶(peroxiredoxin, Prx)是重要成员之一，Prxs可以将过氧化氢、有机过氧化物和过氧化合物分别转化为水、乙醇和亚硝酸盐[7]。Prx属于保守的抗氧化蛋白家族，抗氧化作用显著，广泛存在于原核生物和真核生物中。动物的Prx能够发挥多种生物学功能，具有强大的抗氧化作用，在维持机体氧化还原平衡、细胞凋亡和增殖等方面发挥调节作用[7]。背角无齿蚌(Anodontawoodiana)是双壳类软体动物主要类群之一，已列入濒危贝类物种，常作为淡水污染的指示性生物[8-9]。为了更好地保护淡水资源，对环境污染做出检测，本研究从背角无齿蚌分离出AwPrx4A基因，分析PFOS和PFOA对其表达的影响，为揭示PFOS和PFOA胁迫效应奠定理论基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 背角无齿蚌处理

背角无齿蚌购自南阳市水产市场，PFOS(≥98%)、PFOA(96%)和二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)购自Sigma-Aldrich公司，TRIzol试剂、M-MLV反转录酶、菌株DH5α、克隆载体pMDl9-T、连接酶、PCR产物回收纯化试剂盒和RACE试剂盒均购自宝生物工程有限公司。其余常规药品均为进口或国产分析纯。背角无齿蚌壳长(6.5±0.5) cm，在暴露实验之前，动物置于实验室自动水循环系统中适应养殖2周，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%，每次换水后投喂商品饲料。

半致死浓度(LC50)测定实验的浓度梯度取值采用等差或等比方法，并结合预实验结果进行设置，每个污染物设置5个浓度处理组，每组3个平行样，每个平行10只动物，以正常饲养组为空白对照组，进行48 h急性毒性实验，每12小时观察并记录背角无齿蚌的死亡率，死亡标准以动物外套膜松弛，长时开口，用玻璃棒轻触外套膜缘5 min内无反应，及时捞出死亡个体并予以计数。

为了确定AwPrx4A组织分布，对来自同一塑料盒的6只动物进行解剖，取斧足、鳃、肝胰脏、闭壳肌、心脏、血淋巴和外套膜等组织。PFOS和PFOA溶解于DMSO中以制备储备液。动物处理实验在长方形塑料盒(40 cm×25 cm，高10 cm)中进行，饲养采用人工模拟池塘水(每1 L去离子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[10]。动物分为对照组、PFOS处理组(6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1)和PFOA处理组(50、100、200、400和800 mg·L-1)，对照组用同体积DMSO处理，水中DMSO浓度不超过3‰。分别在0、6、12、24和48 h时每组取出6只河蚌，解剖肝胰脏、鳃和血淋巴，液氮速冻，于-80 ℃保存。

1.2 背角无齿蚌AwPrx4A全长cDNA扩增

总RNA提取采用TRIzol试剂，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，将具有完整rRNA条带的RNA用于合成cDNA，用M-MLV试剂盒合成第一链cDNA，用作PCR反应模板。引物AwPrx4A1和AwPrx4A2参考三角帆蚌、褶纹冠蚌、长牡蛎和爪蟾等物种的基因序列并采用DNAMAN软件予以设计，合成后分离AwPrx4AcDNA保守区域片段，PCR产物连接至pMDT-19载体，双向测序。确定AwPrx4A部分cDNA序列后，根据部分cDNA序列设计的特异性引物(表1)，按照试剂盒要求，扩增AwPrx4AcDNA的5’和3’区域序列，对5’RACE和3’RACE的PCR产物进行测序和拼接。

1.3 序列和系统发育分析

分析AwPrx4A序列，通过GenBank数据库搜索(www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST程序比对；根据http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP上所载信息预测信号肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构域；使用DANMEN分析程序对AwPrx4A基因进行多序列比对；通过Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/)预测AwPrx4A的蛋白质三维结构；使用MEGA5.0软件中的邻接法构建系统进化树。

1.4 AwPrx4A mRNA水平定量检测

为了确定AwPrx4A转录水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(宝生物工程有限公司)按照要求进行定量分析。根据AwPrx4AF和AwPrx4AR引物序列，使用普通PCR仪分离靶基因(表1)，扩增AwPrx4A基因片段长度为180 bp，琼脂糖凝胶电泳仅在检测出的一个条带上进行PCR产物测序和序列鉴别。β-actin作为内参基因，使用ABI7500实时检测系统(Applied Biosystems，美国)进行real-time PCR测定；反应条件为：95 ℃、30 s，1个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40个循环；扩增效率为96.84%；构建标准曲线，通过2-△△CT分析AwPrx4A表达水平。

表1 实时定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

1.5 LC50数据分析

LC50=lg-1[Xm-i×(∑D-0.5)]

式中：LC50为半数致死浓度(μg·L-1)，Xm为污染物最大浓度的对数值，i为相邻2组污染物浓度对数的差值，D为各组背角无齿蚌死亡率(%)。

1.6 统计学处理

2 结果(Results)

2.1 背角无齿蚌AwPrx4A分子结构

背角无齿蚌AwPrx4AcDNA全长由958个核苷酸组成，包含1个120 bp的5’非编码区，1个412 bp的3’非编码区和1个426 bp的开放阅读框(图1)。开放阅读框为由142个氨基酸组成的多肽链，分子量为16.87 kDa，等电点为4.97。SMART结果显示，AwPrx4A包含还原酶结构域(定位在5～155 aa)、烷基脱氢过氧化物还原酶亚基C、巯基特异性抗氧化结构域(AhpC-TSA)(定位在6～139 aa)和C端硫氧化蛋白结构域(定位在159～194 aa)(图1)。

AwPrx4A推导的氨基酸序列中没有发现信号肽序列，包括Cys38、Cys48和Cys79共3个半胱氨酸残基，第1个半胱氨酸残基(IRFGHDWDPTCM)和第3个半胱氨酸(YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT)在所有Prx4A序列中高度保守(图2)。

AwPrx4A蛋白质的二级结构包含5个α-螺旋和6个β-折叠(图3(a))。AwPrx4A的3-D结构与Prx4A家族成员高度相似(图3(b))。

图1 背角无齿蚌AwPrx4A基因的cDNA序列和推导的氨基酸序列注：起始和终止密码用粗体表示，终止信号“AATAAA”以波浪线显示，半胱氨酸保守氨基酸以方框表示。Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AwPrx4A gene in Anodonta woodianaNote: The start and stop codons are indicated with bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the cysteime conserved domains is marked with box.

图2 背角无齿蚌AwPrx4A与其他物种Prx4A序列多重比对注：半胱氨酸保守氨基酸残基用下划线表示。Fig. 2 Multiple alignment of AwPrx4A in Anodonta woodiana with other Prx4ANote: The conserved residues of cysteine are marked with underline.

图3 背角无齿蚌AwPrx4A二级和3D结构预测注：(a). AwPrx4A二级结构；(b). AwPrx4A的3D结构。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwPrx4A deduced amino acids in Anodonta woodianaNote: (a). The secondary structure of AwPrx4A; (b). The 3D structure of AwPrx4A.

2.2 背角无齿蚌AwPrx4A进化关系

BLAST比对结果显示，AwPrx4A与其他物种Prx4A成员关系密切，Prx4A与双脐螺(Biomphalariaglabrata)同源性为94.39%，与黑指纹海兔(Aplysiadactylomela)同源性为93.67%，与长牡蛎(Crassostreagigas)同源性为92.63%，与非洲爪蟾(Xenopuslaevis)同源性为90.51%，与旋毛虫(Trichinellanelsoni)同源性为86.43%。为了进一步分析Prx4A其他Prx序列之间的进化关系，用MEGA5.0系统进化树，包括1-Cys、2-Cys和非典型2-Cys的Prxs。Prx1、Prx2、Prx3和Prx4群集于一个主类群中，构成2-Cys类群。所有Prx6都聚集在一起，组成了一个类群。所有Prx5都形成了非典型的2-Cys子群。Prx4As聚集在一起形成一个独立类群，与非典型2-Cys类群关系相对密切。在Prx4A类群中，AwPrx4A与软体动物包括海兔和双肚脐螺的亲缘关系最近，与人和其他物种亲缘关系相对较远(图4)。

图4 根据背角无齿蚌AwPrx4A氨基酸序列使用邻接法构建的系统进化树Fig. 4 Phylogenetic relationship of amino acid sequence of AwPrx4A between Anodonta woodiana and other organisms

2.3 背角无齿蚌AwPrx4A组织分布

Real-time PCR结果显示，AwPrx4A在背角无齿蚌有广泛的组织分布，包括斧足、外套膜、闭壳肌、心脏、肝细胞、血淋巴和鳃。AwPrx4A在肝胰腺中有较高的表达水平，在鳃、血淋巴、心脏和斧足为中等水平表达，在外套膜和闭壳肌表达水平相对较低(图5)。

2.4 PFOS和PFOA的毒性效应浓度

急性毒性试验结果表明，PFOS和PFOA对背角无齿蚌的LC50分别为28.388和192.083 mg·L-1(表2)。

2.5 PFOS和PFOA对背角无齿蚌肝胰腺AwPrx4A表达的影响

在浓度为6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS处理组中，肝胰腺中AwPrx4AmRNA水平的上调效应呈现时间和剂量依赖模式；与对照组相比，整个实验观察过程中，AwPrx4AmRNA水平在6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS处理组中分别增加了18.75%、2.85倍(P<0.05)、5.08倍(P<0.01)和5.52倍(P<0.01)以上(图6)；与对照组相比，在100 mg·L-1的PFOS处理组，整个实验观察过程中肝胰腺AwPrx4AmRNA水平增加了6.77倍以上(P<0.01)(图6(a))。

图5 背角无齿蚌AwPrx4A基因的空间表达注：每组数据来源于6只动物，重复3次。Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwPrx4A transcript levels from different tissues of Anodonta woodianaNote: The data are obtained from 6 animals, 3 replicates in each group.

与对照组相比，在50、100、200和400 mg·L-1的PFOA处理组中，AwPrx4AmRNA水平分别增加了20.83%、2.21倍(P<0.01)、2.25倍(P<0.01)和3.19倍(P<0.01)。在800 mg·L-1的PFOA处理组中，AwPrx4A的mRNA水平增加了5.64倍以上(P<0.01)(图6(b))。

2.6 PFOS和PFOA对背角无齿蚌鳃AwPrx4A表达的影响

与对照组相比，整个实验观察过程中，背角无齿蚌鳃中AwPrx4AmRNA水平显著增高。在浓度6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1的PFOS处理组中，鳃中AwPrx4AmRNA水平分别增加了61.61%(P<0.05)、86.86%(P<0.05)、2.25倍(P<0.05)、2.75倍(P<0.01)和3.04倍(P<0.01)以上(图7(a))。

与对照组相比，整个实验观察过程中背角无齿蚌鳃中AwPrx4AmRNA水平显著增高。在浓度50、100、200、400和800 mg·L-1的PFOA处理组中，鳃中AwPrx4AmRNA水平分别增加了59.59%(P<0.05)、91.91%(P<0.05)、1.56倍(P<0.05)、2.62倍(P<0.01)和3.45倍(P<0.01)以上(图7(b))。

2.7 PFOA和PFOA对背角无齿蚌血淋巴AwPrx4A表达的影响

与对照组相比，整个实验观察过程中背角无齿蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平显示上调趋势。在浓度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平随呈时间和剂量依赖性增高趋势。在浓度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分别增加了47.42%、67.01%(P<0.05)、1.44倍(P<0.05)和2.43倍(P<0.01)以上。与对照组相比，在浓度为100 mg·L-1的PFOS处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平增加了2.67倍以上(P<0.01)(图8(a))。

图6 PFOS和PFOA对背角无齿蚌肝胰腺AwPrx4A基因表达的影响注：n=6/组/时间点；a、b表示与相应对照组相比有显著差异(P<0.05、P<0.01)。Fig. 6 Temporal expression of AwPrx4A gene in hepatopancreas of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

表2 全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)对背角无齿蚌的48 h-LC50Table 2 48 h-LC50 values of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluoroocanoic acid (PFOA) to Anodonta woodiana

图7 PFOS和PFOA对背角无齿蚌鳃AwPrx4A基因表达的影响注：n=6/组/时间点；a、b表示与相应对照组相比有显著差异(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of AwPrx4A gene in gill of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

图8 PFOS和PFOA对背角无齿蚌血淋巴AwPrx4A基因表达的影响注：n=6/组/时间点；a、b表示与相应对照组相比有显著差异(P<0.05、P<0.01)。Fig. 8 Temporal expression of AwPrx4A gene in hemocytes of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

与对照组相比，整个实验观察过程中背角无齿蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平显著增高。在浓度50、100和200 mg·L-1的PFOA处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平呈时间和剂量依赖性增高趋势。在浓度50、100和200 mg·L-1的PFOA处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分别增加了20.61%、62.88%(P<0.05)和1.64倍(P<0.05)以上(图8(b))。与对照组相比，在浓度为400和800 mg·L-1的PFOA处理组中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分别增加了1.97倍(P<0.01)和2.14倍(P<0.01)以上(图8(b))。

3 讨论(Discussion)

研究表明，AwPrx4A的3个半胱氨酸残基分别位于蛋白序列38、48和79处，第1个和第3个半胱氨酸残基分别位于2个保守结构域IRFGHDWDPTCM和YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT中，提示AwPrx4A可能属于2-Cys Prx类群成员。根据硫氧化蛋白过氧化物酶顺序、结构和功能特征，Prxs可分为3个主要类群：1-Cys、典型2-Cys和非典型2-Cys[11-12]。典型2-Cys型Prx由高度保守的2个半胱氨酸残基组成，并形成二硫键，AwPrx4A中保守半胱氨酸残基位置与典型2-Cys Prxs半胱氨酸所在位置高度重合[13-14]。研究证实，位于多肽链序列第1个半胱氨酸残基与Prxs过氧化物酶活性有关，接受来自Arg128的氢键并将其提供给Glu55羧基。在3个半胱氨酸残基中，第1个半胱氨酸残基和第3个半胱氨酸残基主要参与Prxs结构中的二硫键形成，这是氧化反应中间产物[15]。BLAST同源分析表明，AwPrx4A推导出的氨基酸序列与其他软体动物的Prx4A有超过50%的相似之处。系统发育分析显示，AwPrx4A和Prx4A早期分化，具有明显的独立性，提示Prx4A可能是Prxs的一个新家族，需要在未来阐明其进化特点和功能特性。

AwPrx4A在背角无齿蚌闭壳肌、肝胰腺、鳃、血淋巴、心脏和外套膜等中具有广泛表达和分布，而且还分别表现出了特定表达谱和组织结构特异性。广泛组织分布与AwPrx4A在组织中保持细胞的氧化还原平衡有关。结果显示，鳃中AwPrx4A表达水平最高，作为水生生物的呼吸器官，鳃能够从水中获取氧；鳃暴露在外部环境中，与环境中重金属、有机污染物和病原微生物等直接接触，是环境因子胁迫效应的首要门户，也是机体重要的免疫器官[16]。在选择组织中，在肝胰腺和血淋巴中观察到AwPrx4A有较高水平表达，这与肝胰腺和血淋巴作用有关；背角无齿蚌等软体动物依靠先天免疫实现环境耐受性，在此过程中，肝胰腺和血淋巴在参与集体氧化应激和免疫耐受方面发挥关键的作用。同时肝胰腺作为重要代谢器官，不断地分解和合成各种营养物质及有毒有害物质，细胞容易在代谢过程中遭受氧化应激效应，肝胰腺是对氧化应激的关键防线[17]。

本研究结果显示，PFOS和PFOA对背角无齿蚌的LC50分别是28.388和192.083 mg·L-1，提示PFOS对背角无齿蚌环境毒性比PFOA更高。急性毒性实验结果显示，PFOS和PFOA对水蚤的48 h-LC50分别35和476 mg·L-1，这表明不同类型PFCs毒性差异可能与自身结构有关[1,18-19]。正常情况下，全氟类化合物对大多数生物标志物的细胞毒性效应通常会随着氟原子数量增加而增强；对于同一处理浓度而言，毒性排序为PFOA(C7)

研究发现，PFOS和PFOA处理后背角无齿蚌肝胰腺、鳃和血淋巴中AwPrx4A表达水平显著增加，提示这可能与AwPrx4A可缓解机体氧化应激并提高胁迫耐受性有关。背角无齿蚌属于底栖淡水滤食性生物，PFOS和PFOA很容易在动物进食过程中在细胞内累积下来，其中含有7个或更多氟原子的全氟化合物的累积过程会通过食物链呈现放大效应[20-21]。在ROS压力环境下，较高ROS浓度可能会增加DNA损伤、脂质过氧化反应和蛋白质结构异常的风险。提高抗氧化酶的活性，有助于减少ROS的损伤[20-21]。Prxs是一种抗氧化酶，在消除氧化应激和增强免疫反应方面起着关键作用[20-21]。在中国对虾中注射细菌后，动物血淋巴和肝胰腺中Prx4表达显著提高用以减少ROS的生成和破坏[20]。在弧菌、白斑病病毒、过氧化氢和吲哚沙星等处理南美白对虾后，Prx5表现水平显著提高，增强其环境适应能力[22]。与正常组相比，布鲁氏菌感染后绵羊卵巢中Prx6转录水平显著升高，提高其病原耐受能力[23]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理后的小鼠体内，Prx1基因表达被明显诱导；细菌、病毒和LPS处理的大鼠，Prx3表达水平显著上调，用以增强动物免疫应答能力。环境污染物、高温、聚肌胞(PolyI:C)、细菌和病毒处理水生生物大菱鱼后，Prx6可以被各种压力因素诱导上调。由此可见，Prx家族基因上调与提高环境耐受能力和胁迫能力密切相关，PFOS和PFOA处理对AwPrx4A的上调效应与背角无齿蚌对污染物胁迫抵抗能力的增强密切相关。

与脊椎动物相比，软体动物免疫功能实现主要依靠先天免疫系统来完成。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶和硫氧化蛋白过氧化物酶等一系列抗氧化酶在增强动物的免疫调控能力中发挥关键作用。在软体动物中，维持机体稳态是一个复杂过程，需要肝胰腺、鳃和血淋巴等多个器官参与。PFOS和PFOA处理后，背角无齿蚌肝胰腺、鳃和血淋巴中AwPrx4A表达水平显著增加，这有助于清除机体产生的过量ROS，提高细胞抗氧化能力，增强机体耐受性。