体育场馆内PM2.5的环境行为与急性毒理效应对运动大鼠免疫指标的影响

李峰，由文华，刘沅龙

1. 西安建筑科技大学体育学院，西安 710055 2. Department of Human Performance and Health Education, Western Michigan University, Kalamazoo, Michigan 49008, USA

体育馆内PM2.5的来源主要包括外源性和内源性2种，其中外源性主要包括场馆门窗、围护结构缝隙进入和人员出入时带入等方式[1]；内源性主要包括运动器械设备磨损后产生的颗粒物，馆内人员通过皮肤代谢物、呼吸和服装携带的颗粒物，以及场馆内人员移动荡起的扬尘等[2]。场馆内颗粒物的特征主要表现为来源成分复杂、积累时间长、不容易散发、浓度波动范围小和沉淀速度慢[3]，这种馆内外颗粒物的污染源共同构成了馆内的污染物散发网络。大气细颗粒物的环境行为和健康效应与其物理化学性质有关，例如数浓度、质量浓度、粒径分布和化学组分等[4]。以往研究表明，作为复合型大气污染环境中的主要污染物，PM2.5具有一定的免疫毒性，对运动时各系统组织器官具有较强的损害效应[5]，能引起机体免疫系统疾病，其主要包括炎症反应损伤[6]、免疫损伤[7]、细胞自噬和凋亡等[8]。乔玉成和张琦[9]研究发现，运动过程中的呼吸方式改变、呼吸频率增加、肺扩散能力增强和产热量增加是人体运动状态比安静状态更容易遭到损伤的原因。暴露于PM2.5污染环境下运动，呼吸系统和血液循环系统受到的污染效应与其沉积的污染量有关[10]。樊西宁研究发现[11]，沉积率与呼吸频率、呼吸量成正比，呼吸频率、呼吸量值越大，沉积率的值就越高，污染效应就越大。机体的免疫系统是防御外来有害物质入侵的屏障，因此，研究PM2.5的环境行为、在机体内的转化行为、生物代谢机制以及对运动状态下机体的炎性损伤及其机制，可以为今后在污染环境下运动的可行性评估和人群运动防护提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采样及悬液制备[12]

在某校综合体育馆内用TH-150 C型(武汉天虹)颗粒物智能采样器采集PM2.5，采样时保证采样点周围无堆积物以防遮挡空气流通，同时保证采集点为非污染源。为模仿人体呼吸带的高度，采样时使仪器放置高度为1.5 m，即人体呼吸带高度，采用同心圆方式选取5个点，2点之间相距5 m左右，离墙>1 m、离门窗>3 m，空气流量为1.13 m3·min-1。按照仪器操作规则，使采气流量保持定值，每天24 h连续采样，持续30 d，根据采样前、后滤膜质量差和采样体积得出颗粒物的质量浓度。采样时将已称重的滤膜用镊子放入结晶采样夹的滤网上，滤膜毛面朝进气方向，将滤膜压紧至不漏气。采样完毕后将PM2.5收集在玻璃纤维滤膜上，然后将滤膜裁剪为小块后浸入去离子水中，经超声振荡30 min×4次后用去离子水洗脱颗粒物，然后将滤液在4 ℃离心20 min(速度1 000 r·min-1，离心半径59 mm)，真空干燥后称重，-20 ℃保存。为保证颗粒物实际毒性效果，实验并未对颗粒物进行消毒灭菌处理，染毒前用0.9%生理盐水配制成需要的浓度，使用前超声振荡15 min使染毒悬液均匀，并灭菌备用。

1.2 实验动物染毒剂量与染毒方式

PM2.5采用气管滴注法染毒，室内温度保持在20～26 ℃之间，湿度为44%～70%。滴注前受试物的温度维持在37 ℃左右，将染毒悬液预温至37 ℃，在乙醚麻醉后，3组实验动物分别按低(7.5 mg·kg-1)、中(15 mg·kg-1)和高(30 mg·kg-1)剂量经气管注入PM2.5颗粒物染毒悬液，滴注体积为3 mL·kg-1(体重)，对照组滴注同等容量的生理盐水，实验大鼠染毒后1 h进行运动。

1.3 实验动物分组与运动方案

实验动物选用7周龄SPF级(specific pathogen free, SPF)健康成年雄性Wistar大鼠32只(由西安交通大学医学院动饲养中心提供)，体重180～220 g。动物购回后在常规饲养笼内适应性喂养7 d，饲养室内温度20～26 ℃、湿度为44%～70%，自由进食和饮水(饲料购自西安交通大学医学院动物房)，照明随同光照自然变化。所有动物均依照《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求进行处置[13]，染毒时间为训练前1 h。训练前将大鼠随机分为4组，分别为运动对照组(EC)、低剂量(7.5 mg·kg-1)运动组(LPE)、中剂量(15 mg·kg-1)运动组(MPE)和高剂量(30 mg·kg-1)运动组(HPE)，每组8只，根据大鼠体重/摄氧量回归方程建立递增负荷运动模型，正式训练前将所有实验大鼠先进行2 d的适应性训练，速度和时间分别以10 m·min-1、5 min·d-1进行，训练方式为跑台；然后所有动物进行1 d的训练前恢复，随后按照15 m·min-1、15 min(相当于45%最大摄氧能力)，18 m·min-1、20 min(相当于50%最大摄氧能力)，21 m·min-1、30 min(相当于65%最大摄氧能力)，24 m·min-1、40 min(相当于70%最大摄氧能力)，27 m·min-1、50 min(相当于76%最大摄氧能力)的递增负荷形式进行。

1.4 血清和肺泡灌洗液(BALF)制备与指标测试

实验结束后即刻用20%乌拉坦溶液腹腔注射麻醉后处死大鼠，腹主动脉取血，肝素抗凝，37 ℃恒温水浴5 min后3 500 r·min-1离心15 min，分离血清并于4 ℃冰箱保存备用。克拉拉细胞蛋白(CC16)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、大鼠巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的检测均采用双抗体夹心法(ABC-ELISA)，使用仪器为日本Olympus AU 400全自动生化分析仪，ELISA试剂盒购自上海雅吉生化试剂六厂，所有操作均严格按说明书进行。

2 结果(Results)

2.1 PM2.5对大鼠血清中免疫蛋白的影响

由表1可知，和EC组相比，LPE、MPE和HPE中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP随剂量增加而升高，NE和CC16则随剂量增加而降低。

2.2 PM2.5对大鼠BALF中免疫蛋白的影响

表2数据显示，和EC组相比，随着PM2.5滴注剂量的增加，LPE、MPE和HPE组MCP-1、MIP-1α和hs-CRP表现出升高趋势，差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，NE和CC16则随着PM2.5剂量的升高而降低。

注：EC表示运动对照组，LPE表示低剂量运动组，MPE表示中剂量运动组，HPE表示高剂量运动组；MCP-1表示单核细胞趋化蛋白-1，MIP-1α表示巨噬细胞炎症蛋白，hs-CRP表示超敏C反应蛋白，NE表示中性粒细胞弹性蛋白酶，CC16表示克拉拉细胞蛋白；与EC比较，*P<0.05、**P<0.01。
Note: EC represents exercise control group; LPE represents low-dose exercise group; MPE represents middle-dose exercise group; HPE represents high-dose exercise group; MCP-1 represents monocyte chemoattractant protein-1; MIP-1α represents macrophage inflammatory protein-1α; hs-CRP represents hypersensitive C-reactive protein; NE represents neutrophil elastase; CC16 represents Clara cell protein 16; compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

注：与EC比较，*P<0.05、**P<0.01。
Note: Compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

3 讨论(Discussion)

3.1 PM2.5的环境行为对血清和BALF中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP的影响

袁鹏和安蕾[14]研究发现，PM2.5可以富集包含有机物、酸性氧化物、重金属、细菌和病毒等有害物质进入呼吸道，甚至通过血液循环进入全身各系统，对机体造成伤害。尤其是在运动状态下，人的呼吸以及各种带香味的护理用品会散发柠檬烯等萜烯类化合物，萜烯类化合物也能与O3反应产生颗粒物，从而导致颗粒物浓度增加[15]。同时，运动人群裸露的皮肤、毛发和皮肤油的某些成分作为场馆内颗粒物的内源性来源可以与O3快速反应生成超细颗粒物(ultra-fine particules, UFPs)，而UPFs是一类以惰性碳为中心的颗粒物，具有极大的比表面积且有着很强的核吸附能力，可以损坏肺泡巨噬细胞清除有害物质的能力，并能通过上皮屏障，释放大量的炎性介质从而引起更强炎性反应[16]。

在运动过程中随着呼吸的加深加快导致机体的肺活量和肺通气效率都增加，以满足机体运动的需要，但同时也必然会吸入更多的PM2.5。MCP-1趋化因子是一类参与机体多种机能活动的重要免疫应答调节因子，在急性组织损伤中也发挥着重要的作用，具有诱导单核细胞趋化和激活单核细胞的双重功效[17]。除了细胞免疫反应之外，MCP-1还可以构成早期抵御微生物侵入的防线[18]，诱导单核细胞表面粘附分子及细胞因子白细胞介素1 (IL-1)和白细胞介素6(IL-6)的表达，调节单核细胞的多种功能[19]。本实验研究结果显示，急性PM2.5暴露对运动大鼠部分血清免疫蛋白产生不利影响，且不同剂量的PM2.5所引起的机体免疫反应是不相同的，具体表现在随着PM2.5暴露剂量的增加，血清和BALF中MCP-1表现出剂量相关性升高趋势；相应机制可能是由于PM2.5进入机体后具有一定的生物蓄积行为，其所含的各种有害物质会对组织细胞的抗氧化酶及内稳态造成破坏，通过氧化应激反应相关转录因子刺激前炎性细胞素的释放，引发炎症反应失衡[20]。PM2.5中的有机污染物由于具有较强的疏水性，进入机体后可以与机体内各种免疫因子、免疫蛋白结合[21]，使得PM2.5的迁移、分配和生物反应等出现不稳定性的生物-化学危害效应。

由于MIP-1α在炎症、创伤等刺激下出现炎症性表达，参与机体的应激反应[22]。因此，在运动大鼠接受PM2.5暴露和短时间大强度应激2种刺激后，血清和BALF中MIP-1α表达增加，可能是PM2.5作用机体后产生的一系列因素综合作用的结果，比如氧化应激、信号传导、细胞因子的产生和脂质过氧化等[23]。

hs-CRP作为机体对外界环境污染、运动应激时分泌的急性应激免疫细胞因子，是免疫网络的重要组成部分，它的表达与分泌不仅与免疫细胞的分化增殖和功能发挥密切相关，也是评价呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指标，可以反映呼吸道的损伤程度及肺-血屏障的完整程度[24]。PM2.5暴露后运动大鼠血清和BALF中hs-CRP升高，且低剂量组和高剂量组中hs-CRP与对照相比差异有统计学意义，其原因可能是由于PM2.5的毒性作用增加了运动过程中血管内皮细胞表面可溶性细胞间黏附分子的表达。由于hs-CRP是一种的急性应激蛋白，其水平的高低反映了应激反应的强弱[25]，组织间通过直接(浸润、聚集)或间接(产生细胞因子)作用，引起一定部位的组织损伤和炎症反应[26]。

3.2 不同剂量PM2.5对血清和BALF中NE和CC16的影响

场馆内外PM2.5在呼吸系统的沉积浓度会有差别，但是在不同器官的沉积效率却较为相似[27]。实验研究发现，颗粒物在鼻腔咽喉部的沉积部分最大，但是真正对机体造成损害的沉积部位却是肺泡部位[28]。因为细颗粒物可以通过肺部的血液循环到达全身各处。因此，本实验中BALF和血液中免疫指标的变化可以很大程度上代表PM2.5对机体其他器官的免疫损害。

CC16作为肺上皮细胞的特异性蛋白，可以保护呼吸道、抵御氧化应激和免疫调节等，同时也是评价呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指标，具有抗炎、抗纤维化及活跃的增殖分化能力[29]。本研究结果显示，与EC组相比，CC16随着PM2.5剂量的增加而降低且有统计学意义。这表明，在此运动模型中PM2.5暴露可以破坏机体的肺-血屏障的完整程度[30]，造成肺上皮细胞膜的通透性增加，从而使蛋白从血管外渗透到血管内，对呼吸系统造成损伤。

NE在体外循环引起的组织器官损害中起着重要作用，其作为判断组织免疫损伤强度的一个指标，NE指标的变化反映了机体免疫系统对外界刺激反应能力的敏感程度[31]。机体免疫系统受到外源性刺激的大小、炎性介质释放量的多少以及组织损伤的程度都与NE的释放量有关。本实验结果显示，大鼠在PM2.5暴露的刺激下NE的含量降低，表明机体PM2.5可破坏细胞间的紧密连接和基底膜的完整性，使血管通透性增加，加重气道炎症，导致一过性气道狭窄及阻塞，引起通气功能下降[32]，同时机体的中性粒细胞在PM2.5的刺激下会释放较少的炎性介质，这在免疫学上称为初始启动[33]，当作为免疫应激反应的免疫蛋白过多时，会使免疫系统受到叠加效应，如果这种叠加效应超过了神经-内分泌-内稳态的控制水平，则分解细胞外基质，导致炎症发生迁移。

综上，机体的免疫反应与PM2.5环境行为和代谢毒理之间存在着直接的耦合关系，且受到多种因素的影响。PM2.5在组织细胞内的粘附、迁移和毒性作用导致的细胞形变会驱动细胞膜脂质重组，改变细胞膜间隙的通过能力。BALF和血清分别作为肺组织和血液循环系统的代表，其机械屏障会受到PM2.5的攻击入侵。而免疫蛋白作为免疫应激反应的标志性蛋白，不同剂量的PM2.5暴露对大鼠免疫指标的影响可以有效指示运动大鼠暴露于环境污染物的健康风险。MCP-1、MIP-1α、hs-CRP、NE和CC16的变化也进一步解释了PM2.5对生物体致炎作用的机制与免疫蛋白的表达水平有关。