交叉等温扩增技术快速检测幽门螺杆菌方法的建立

刘文鑫 袁超文 王莹莹 冯瑜菲

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.Pylori）是一种全球最常见的寄生于人类胃黏膜的革兰氏阴性微需氧菌，被世界卫生组织国际癌症研究机构（WHO/IARC）定义为I类致癌因子，也是引起慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病的主要因素[1-2]。在世界范围内大约50%以上的人口感染Hp，尤其在发展中国家和不发达国家地区感染率更高[3]，我国Hp的总感染率调查结果显示，我国人群总感染率高达50% 左右，且流行发病率呈逐年增高趋势[4]。Hp的毒力因子主要包括细胞毒素相关基因（cagA）、空泡毒素基因（vacA）和尿素酶基因（ureA、ureB）和磷酸葡萄糖氨基转移酶基因（ureC）等，尿素酶基因为H. pylori感染的首要因素，可通过定植胃黏膜上皮细胞并刺激分泌细胞因子诱发炎症反应[5]。目前，对于幽门螺杆菌的检测手段主要包括侵入性检测（内镜成像、病理组织学检查、快速脲酶试验等）和非侵入性检测（尿素呼气试验、粪便抗原检测和血清学检测等）[6]，但每种方法都存在着其各自的优缺点和临床应用的限制，如快速尿素酶试验会对胃黏膜造成损伤，且不适用于凝血功能差或服用抗凝药物的患者[7]。UBT 被认为是目前诊断幽门螺杆菌的“金标准”，但检测耗时长、成本较高[8-9]。分子生物学（如real-time PCR法）可被用来快速检测H. pylori，但其应用大多需要昂贵仪器，限制了在基层医院和防疫部门推广。因此，快速、低廉、高效地检测H. pylori感染对公共医疗事业具有重要意义。与传统的分子生物学检测方法相比，等温扩增技术可通过具有链置换活性的聚合酶和特异性引物在恒定温度下完成快速扩增，因其操作简便、快速准确且无需昂贵设备仪器等优势，现已被广泛用于医学检验等方面[10-11]。本研究应用一种新的交叉引物等温扩增技术（Cross-priming amplification，CPA），针对幽门螺杆菌尿霉素B基因（UreB）设计特异性引物建立一种无创、高特异性和灵敏性的快速检测方法，可为基层医疗单位和防疫部门提供操作更为简单的快速诊断方法。

1 材料与方法

1.1 主要菌株、试剂与仪器

DNA提取试剂盒（TAKARA）、dNTPs（TansGen）、甜菜碱（Sigma-Aldrich）、琼脂糖（Wissen）、Bst DNA聚合酶（New England Biolabs）、反应引物（上海生工生物工程公司合成）；电泳仪（北京六一）、凝胶成像系统 2500R （Tanon）、浊度仪（HACH）、台式高速离心机（Eppendorf）、电热恒温水浴锅（欧莱博 H-W420）。

菌株采用2株幽门螺杆菌及7株其他相关阴性菌：幽门螺杆菌ATCC 26695、ATCC 43504、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、大肠杆菌ATCC 43886、副溶血性弧菌ATCC 27519、产气荚膜梭菌ATCC 13124、嗜水气单胞菌ATCC 7966、肠出血性大肠杆菌ATCC 35150均为本研究室保存。

1.2 引物设计

以幽门螺杆菌的尿霉素B基因（UreB）序列（GenBank登录号：AY714224.1）为靶基因，设计3套CPA特异性引物（分别命名为HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3），序列见表1。

表1 幽门螺杆菌CPA扩增引物

1.3 模板DNA的制备

使用DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌DNA基因组，具体方法见试剂盒说明书。

1.4 反应的体系建立与优化

首先对3套CPA特异性引物进行验证，反应体系25 μL包含：2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、20 mmol/L MgCl22.5 μL、10×bst Buffer 2.5 μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL、8 U Bst DNA聚合酶、待测样品基因组 DNA 2 μL。HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3引物量分别为：F1为5 μL，F5F/F5B各2 μL，F3/B3各0.5 μL，以上引物浓度均为10 μM，并在60℃恒温条件下每隔3 min取样一次，连续孵育72 min，扩增结果用浊度仪于650 nm处进行测定。

为确定CPA最佳的反应温度、Bst DNA聚合酶浓度和反应时间，每个反应均需重复三次，选择上述建立的扩增最好的特异性引物分别对反应温度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃）、Bst DNA聚合酶浓度（6 U、8 U、10 U和12 U）、以及反应时间（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min），反应结果用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.5 特异性试验

本研究共使用9株实验菌（2株幽门螺杆菌和7株其他致病菌）进行特异性检测，同时设定不添加模板的阴性对照并与PCR法比较，扩增产物均用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.6 灵敏度试验

取幽门螺杆ATCC 26695菌液1 mL进行平板计数，经测得初始菌液浓度为1.26×108cfu/mL，PBS对菌液10倍倍比稀释至1.26×102cfu/mL，随后调整50 cfu/mL和25 cfu/mL共9个稀释度。分别吸取2 μL稀释后的菌液作为模板进行灵敏度试验，试验重复三次。

1.7 临床组织样本检验

对2017年7月—2018年6月收集的75例临床胃黏膜组织样本，进行13C-尿素呼气试验（13C-UBT）法检测，其诊断结果作为参照标准，随后进行CPA扩增检测，扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.8 统计学处理

应用 SPSS 17.0 统计分析软件对检测结果进行分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPA方法的建立与优化

本研究设计的3套CPA特异性引物均具有良好的特异性，但HCPA-3的扩增效果最佳，可在60℃条件下完成对UreB基因的大量扩增（见图1A）。随后对HCPA-3特异性引物的反应温度、Bst DNA聚合酶浓度和扩增时间分别进行了优化，结果表明：反应温度在62℃、Bst DNA聚合酶浓度为6 U、孵育时间于60 min时扩增效率为最高（见图1B-D）。

2.2 特异性试验

用上述优化的CPA方法分别对9株不同的致病菌进行特异性试验，需重复三次。2%琼脂糖电泳结果显示，其中2株幽门螺杆菌扩增结果均为阳性，其余7株阴性相关扩增结果均为阴性，且与PCR方法检测结果相同，说明CPA法特异性较高，且对幽门螺杆菌检测具有很好的通用性（见图2）。

2.3 敏感性试验

将过夜培养的纯菌液由1.26×108cfu/mL依次10倍稀释至1.26×102cfu/mL，随后稀释50 cfu/mL和25 cfu/mL共9个稀释度进行敏感性试验。反应结果如图3所示，CPA方法检测的灵敏度达1.26×102cfu/mL。

2.4 临床胃黏膜组织样本检测结果

对收集的75例临床胃黏膜组织样本进行13C-尿素呼气试验（13C-UBT）检测作为“金标准”，共检测出H. pylori阳性27株，阳性检出率为36.0%；而CPA法共检测出H. pylori阳性26株，阳性检出率为36.67%，检测灵敏度达96.30%（26/27），且两种方法的阳性检出率差异无统计学意义（P=0.53）。

3 讨论

图1 CPA特异性引物的筛选与优化

图 2 特异性试验

图3 敏感性试验

幽门螺杆菌在全世界各地人群中感染率均较高，并与年龄、种族、性别和地理分布等因素密切相关，发展中国家的患病率高达50%～70%[12]，故研究者不断开发各种诊断幽门螺杆菌的技术，以寻找一种快速、简单、高特异性的诊断方法。传统的H. pylori诊完成对UreB基因的大量扩增。特异性试验结果显示，HCPA-3特异性引物的通用性较好，不识别其他非幽门螺杆菌，但本研究选用的其他致病菌种类较少，导致特异性试验结果较为局限，应在下一步的研究中加以完善。敏感性实验结果显示，CPA法的检测极限为1.26×102cfu/mL，与之前报道的Realtime PCR方法的灵敏度相近，可满足低浓度目的基因的检测。通过对75例临床胃黏膜组织样本检测，同“金标准”13C-尿素呼气试验法检测结果相符，其准确率为96.30%（P＞0.05）且无假阳性出现。由此可见，CPA法检测幽门螺杆菌的灵敏度和特异度均较高，能够快速、准确和高效的完成对H. pylori感染的诊断。

CPA法虽在实际应用中对设备的依赖性比PCR或real-time PCR法更为简单，但在扩增过程中会合成大量的DNA，形成的气溶胶断检测主要以“金标准”UBT法为代表，但对于已接受胃镜检查的患者，再进行UBT 检测则增加了时间和经济成本。近年来，以PCR法为代表的分子生物学技术作为一种重要的基因诊断方法克服了操作繁琐、耗时较长的缺点，并在许多领域得到了迅速的应用与发展，Real-time PCR常被用于检测组织样本中DNA含量[13]，但该方法的开展需要专业操作人员和高昂的检测设备，对很多条件简陋的临床医学实验室来说这依旧是个难题。

CPA 是一种近年新出现的等温扩增技术，其原理与环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相似，现已成功应用到多种细菌和病毒的核酸检测当中[14]。本研究针对幽门螺杆菌UreB基因设计特异性引物，并优化反应温度、Bst DNA聚合酶浓度、反应时间等参数，成功建立了一种快速、简单的新型检测技术，从加样到反应结束整个过程可在1.5h内易对周围环境造成污染，所以在配置体系时应防止DNA模板和反应试剂污染，避免形成假阳性结果。向反应体系内加入核酸染料，利用颜色的变化判定检测结果，但在反应结束后开盖一样不能避免气溶胶造成的污染，开发封闭防污染的试纸条虽然可以解决上述问题，但由于专利保护的限制，加大了开发的难度。因此，对于等温扩增技术还应不断地探索与完善，寻找更多解决问题的方法。

综上所述，本研究建立的CPA快速检法，不仅具有时间短、低成本、检测效率高的特点，且不需要依赖昂贵的仪器设备和专业的操作条件，为基层医院和防疫部门检验幽门螺杆菌性感染提供一种新的思路。