3 种不同产地灵芝子实体主要化学成分比较

闫 征，郝利民*，张黎明*，康彩彩，马天娇，崔 燕，郑志强

（1.北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100176；2.军事科学院军需工程技术研究所，北京 100010；3.天津科技大学 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）

灵芝（Ganoderma lucidum）是真菌界、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属的一种药食两用真菌，作为中国传统名贵滋补药材，具有补中益气、扶正固本、延年益寿的功效[1]。现代科学研究表明，灵芝除含有多糖、灵芝酸、蛋白质、脂肪酸等活性成分外，还含有人体所需的膳食纤维、脂肪、氨基酸、微量元素和矿物质等[2]，具有抗氧化、调节免疫力、抑制肿瘤、提高机体耐缺氧能力等功效[3-4]，对于治疗高血压、高血脂、肝病、心血管等疾病也具有良好的临床效果[5]。

随着灵芝需求量的不断增加，消费者和灵芝深加工企业迫切需要品质优良、质量稳定的灵芝子实体，但由于种植方式、环境条件、加工工艺等因素导致人工栽培灵芝子实体的品质参差不齐[6-7]，进而影响相关产品的稳定性，而归根结底是由灵芝子实体中化学成分的差异所致。目前，对不同产地人工栽培灵芝子实体间差异的对比分析，主要集中在多糖、灵芝酸等活性成分[8-9]，而关于其他化学成分差异的研究报道较少。因此本研究从人工栽培灵芝的主要产区选取3 种灵芝子实体，对其主要化学成分（多糖、灵芝酸、氨基酸和脂肪酸等）进行对比分析，以期为进一步完善灵芝的质量标准和作用机理提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人工栽培灵芝子实体采集时间为2016年10月，由天津药物研究院中药现代研究部鉴定；安徽1号来自安徽省六安市金寨县，吉林1号来自吉林省通化市通化县，吉林2号来自吉林省吉林市蛟河市，测试前，将灵芝子实体洗净后80 ℃烘干，粉碎备用。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Thermo Fisher Scientific公司；灵芝酸A（SMB00445）、葡萄糖（G 7528）标准品 美国Sigma公司；灵芝酸B（HG220652）标准品 宝鸡市晨光生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JA12002电子天平 上海精科天平仪器厂；PHSJ-4A pH计 上海雷磁仪器厂；TGL16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂；DGG电热鼓风干燥箱 天津天宇机电有限公司；K9840自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；L-8800氨基酸全自动分析仪日本日立公司；1260高效液相色谱仪、6890-5975C气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX Extend-C18（250 mm×4 mm，5 μm） 美国安捷伦公司；AA-6800原子吸收光谱仪、UVmini-1240紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器制造有限公司；SX2-12-10马弗炉 北京市永光明医疗仪器厂；DZKW-4电子恒温水浴锅 南昌市恒顺化验设备制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常规营养成分测定

水分含量的测定采用直接干燥法，参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[10]；粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法（粗蛋白质含量=总氮含量×6.25），参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[11]；粗脂肪含量的测定采用索氏脂肪抽提法，参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[12]；碳水化合物含量的测定参照GB/Z 21922—2008《食品营养成分基本术语》[13]；灰分采用灼烧重量法直接测定，参照GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[14]。

1.3.2 氨基酸含量测定

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[15]，采用酸水解法处理样品，因此不考虑色氨酸的检测。

试样水解：精确称取一定量的样品放入水解管中，加入10 mL 6.0 mol/L HCl溶液，抽真空至真空度接近0 Pa后维持10 min，管口密封后110 ℃水解22 h，取出冷却至室温，过滤去除杂质，取滤液1 mL于10 mL比色管中，60 ℃水浴10 min，真空干燥器中蒸干，然后加入适量0.02 mol/L HCl溶液，在空气中放置30 min后进行测定。

试样测定：使用混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪，参照JJG 1064—2011《氨基酸分析仪检定规程》及仪器说明书进行试样的测定，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸浓度，色谱柱为磺酸型阳离子树脂，检测波长为570 nm和440 nm。

1.3.3 多糖含量测定

水溶性多糖提取条件：料液比1∶20（g/mL）、提取温度100 ℃、提取时间2.5 h、提取2 次。提取结束后合并滤液，经浓缩、醇沉、4 ℃静置，离心，冻干，得灵芝子实体水溶性粗多糖。

碱溶性多糖提取条件：提取溶液用4% NaOH溶液调节pH 13.5，料液比1∶30（g/mL）、提取温度80 ℃、提取时间2 h、提取2 次。提取结束后合并滤液，经浓缩、醇沉、4 ℃静置，离心冻干得灵芝子实体碱溶性粗多糖。

水溶性多糖和碱溶性粗多糖按式（1）计算粗多糖提取率：

多糖含量采用苯酚-硫酸法[16]进行测定。以葡萄糖为标准单糖，用紫外-可见分光光度计在490 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线按式（2）计算多糖含量：

1.3.4 灵芝多糖的单糖组成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）柱前衍生高效液相色谱法[17]，对3 种不同来源多糖的单糖组成进行分析，具体操作过程如下：

水解：准确称取纯多糖样品5.0 mg，置于10 mL安培管中，加入2.0 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，充入氮气5 min，保护管中样品，防止在水解过程中氧化，用喷灯封住管口，置于110 ℃烘箱水解2 h，取出冷却至室温，在管中加入5 mL甲醇，氮气吹干，重复3 次以除尽管中残留的三氟乙酸，然后向其中加入1 mL蒸馏水，得多糖水解产物。

衍生：取水解液100 μL，加入100 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，混合均匀，于70 ℃中水浴30 min。水浴结束后取出冷却至常温后，加入100 μL 0.3 mol/L的HCl溶液，混合均匀。再加入900 μL氯仿将多余的PMP萃取除去，重复3 次。最后加入500 μL的蒸馏水稀释，0.22 μm滤膜过滤，制得多糖水解单糖衍生物，以供分析。

检测：色谱柱：ZORBAX Extend-C18（250 mm×4 mm，5 μm）；流动相：0.1 mol/L磷酸盐（pH 6.7）缓冲液-乙腈（83∶17，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm；进样量：20 μL。

1.3.5 脂肪酸含量测定

参照GB 5009.6—2016[12]，先以石油醚（60～90 ℃）为提取溶剂，用索氏抽提法提取粗脂肪，然后用KOH-甲醇碱催化法对样品进行预处理，用GC-MS联用仪进行分析，具体操作如下：

脂肪酸甲酯化：取索氏抽提粗脂肪样品100.0 mg于比色管中，依次加入5 mL正己烷-乙醚（2∶1，V/V）和3 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，振荡混匀后超声波处理10 min，再向比色管中加入5 mL纯水，振荡混匀后转移至离心管中，4 000 r/min离心2 min后取上层脂肪酸甲脂备用。

色谱条件：色谱柱为VF-5MS型毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度99.999%），柱流速为1 mL/min，分流比为5∶1；升温程序：柱初温为80 ℃，保温2 min，以10 ℃/min速率升温至200 ℃，再以5 ℃/min速率升温至290 ℃，保温5 min；进样口温度为280 ℃；进样量为0.5 μL。

质谱条件：电子电离源，传输线温度为280 ℃，离子源温度为220 ℃，扫描方式为全扫描，扫描范围为m/z50～500，溶剂峰切除时间为6 min。

1.3.6 微量元素含量测定

将0.500 0 g样品与15 mL HNO3-HClO4（4∶1，V/V）消化液混合，用电子万用炉加热样品至微沸，待溶液变成淡黄绿色或无色，且瓶中出现白色烟雾后，冷却至室温，再加少量水继续加热以除去残留的酸，重复3 次，然后用AA-6800型火焰原子吸收光谱仪进行测定。同时做空白样和平行样。

1.3.7 灵芝酸A和灵芝酸B含量测定

3 种灵芝子实体中灵芝酸A和B含量测定参照文献[18]。具体操作如下：

色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为35%乙腈-65% 0.1%醋酸溶液，检测波长为254 nm；柱温为25 ℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min。

前处理：称取100.0 mg灵芝子实体粉末，加入适量甲醇超声处理25 min，并定容于25 mL容量瓶，制得供试液。

标准曲线：精密称定灵芝酸A标准品0.5 mg，灵芝酸B标准品0.5 mg，加适量甲醇超声处理25 min，定容于25 mL容量瓶，摇匀，得标准品溶液。将标准品溶液稀释成不同质量浓度，分别吸取不同质量浓度的标准品溶液10 μL，0.45 μm有机滤膜过滤，进样并记录峰面积。

2 结果与分析

2.1 基本指标分析

表1 3 种灵芝子实体的常规成分含量（干质量）Table 1 Proximate chemical composition (dry basis) of three samples of G. lucidum

由表1可知，在3 种灵芝子实体中，安徽1号的能量、粗蛋白和碳水化合物含量最高，吉林1号的粗脂肪含量最高，而吉林2号的粗纤维含量最高，安徽1号和吉林1号样品的灰分和水分含量相近，均低于吉林2号。

中草药药理作用的发挥需要一定的物质基础，除功效活性成分外，营养物质的组成与其药理作用也存在紧密的联系[19]，通过对比3 种灵芝子实体的常规成分可知，产地是影响灵芝子实体营养成分组成和含量的重要因素，即使是同一省内不同区域的灵芝子实体，其营养成分也存在一定差异。

2.2 氨基酸含量

表2 3 种灵芝子实体氨基酸含量Table 2 Amino acid contents of three samples of G. lucidumg/kg

由表2可知，3 种灵芝子实体中共检测出17 种氨基酸，包括7 种必需氨基酸和10 种非必需氨基酸，因采用酸水解法而色氨酸无法检出。氨基酸总量由高到低依次：安徽1号（46.35 g/kg）＞吉林2号（41.72 g/kg）＞吉林1号（19.16 g/kg），与3 种灵芝子实体蛋白质含量（表1）检测结果顺序一致。3 种灵芝子实体中，必需氨基酸总量占氨基酸总量的30%～40%，其中安徽1号灵芝子实体的氨基酸总量、必需氨基酸含量与吉林2号相近，但与吉林1号存在显著差异。安徽1号与吉林2号的氨基酸总量与文献[20]报道相近，而吉林1号的含量较低，这可能是由于菌种、栽培方式、椴木品种和采收期限等因素导致灵芝子实体中氨基酸组成和含量的差异。

氨基酸不仅是一种常规营养物质，还具有重要的功效活性[21]，如合成蛋白质、糖异生底物、神经递质和信号转导分子的前体及蛋白质周转的调节物等，在生物体生长发育和组织修复更新中具有重要作用。灵芝是氨基酸的“贮存库”，具有氨基酸种类多、含量高、活性高、易被人体吸收的特点，其中亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸3 种支链氨基酸（branched-chain amino acids，BCAA）总量均较高（安徽1号9.85 g/kg；吉林1号4.06 g/kg；吉林2号8.61 g/kg），BCAA不仅具有抗疲劳和增强运动能力的功能，在减轻运动性肌肉损伤和抑制延迟性肌肉酸痛发生等方面也具有显著作用[22]，灵芝具有显著抗疲劳功效，可能与其子实体中高含量的BCAA有关。在3 种灵芝子实体中谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸含量也较高，天冬氨酸在人体内可被转化为谷氨酸，而谷氨酸不仅具有较强的降血氨作用，还是神经中枢和大脑皮质的重要补充剂，可作为能源替代物延缓能量物质耗竭，从而达到促进运动疲劳恢复的功效，并能促进机体运动过程产生的代谢废物及有毒物质的清除，而甘氨酸作为一种非必需氨基酸，除参与蛋白质和许多重要代谢性生理分子的合成外，还有抗炎和免疫调节作用，这可能与灵芝显著的抗疲劳和免疫调节作用相关。

2.3 灵芝多糖测定结果

2.3.1 多糖含量

图1 3 种灵芝子实体的水溶性粗多糖和碱溶性粗多糖提取率Fig. 1 Yield of crude polysaccharides extracted from three samples of G. lucidum and their polysaccharide contents using water extraction and alkali extraction methods

由图1可知，3 种灵芝子实体中的水溶性粗多糖提取率相近，且均符合《药典》（2015版）的标准。而碱溶性粗多糖提取率差异较大，其中吉林2号的最高，吉林1号的最低，但均显著高于水溶性粗多糖。碱液较中性水能更有效破坏灵芝子实体细胞壁的纤维质超聚结构，进而促进细胞内物质的溶出，包括蛋白质、糖蛋白、多糖等，尤其是含有糖醛酸的多糖、酸性多糖和复合多糖等，从而使碱溶性粗多糖提取率显著增加。由图1还可知，碱溶性粗多糖中多糖含量低于水溶性粗多糖，一方面可能是由于碱溶性粗多糖中的酸性多糖在中性水中的溶解度较低，导致无法用苯酚-硫酸法检出，另一方面可能是由于较强的碱液使某些多糖发生水解。

灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一[23-24]，与灵芝的多种药理活性和保健功效密切相关，其含量是《药典》（2015版）中判定灵芝品质和药用价值的重要指标之一，吕兴萍等[25]研究发现，影响灵芝多糖含量因素较为复杂，除产地因素外，还与灵芝的栽培技术、采收条件和预处理等有关。

2.3.2 单糖组成对比

9 种标准品单糖在高效液相色谱检测中得到完全分离，各标准品单糖的出峰时间、标准曲线方程以及相关系数如表3所示。

表3 各标准品单糖的出峰时间和标准曲线Table 3 Peak times of monosaccharide standards and standard curves

将3 种不同来源灵芝子实体粗多糖分别进一步分离纯化，所得纯多糖的单糖组成检测结果见表4。

表4 3 种灵芝子实体分离纯化所得纯多糖中单糖相对含量Table 4 Monosaccharide compositions of purified polysaccharides from three samples of G. lucidum

由表4可知，3 种样品所得纯多糖的单糖组成差异较大，其中从安徽1号分离纯化所得纯多糖主要由半乳糖、鼠李糖和核糖组成，从吉林1号分离纯化的纯多糖主要由半乳糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖组成，而吉林2号纯多糖主要由木糖、葡萄糖、岩藻糖和鼠李糖组成，3 种灵芝子实体纯多糖中均含有鼠李糖，安徽1号和吉林1号灵芝子实体多糖的主要单糖是半乳糖，占其质量的50%以上，而在吉林2号灵芝子实体多糖中没有检测到半乳糖，其单糖组成主要是木糖。

单糖是多糖的组成单位，其组成和比例与多糖的高级结构、溶解性和生物活性等密切相关，如何高效、准确、稳定地检测多糖的单糖组成，一直是活性多糖品质分析和质量控制的热点。关于灵芝多糖单糖组成的研究较多，如梁加贝等[26]采用高效毛细管电泳法测得灵芝多糖中葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖的物质的量比为4.5∶2.8∶1.3∶3.6，叶素丹[27]采用气相色谱法测得灵芝多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖组成，以葡萄糖和半乳糖为主。灵芝子实体多糖的单糖组成与灵芝产地、菌种、检测方法等因素有关，归纳起来，葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖是灵芝子实体多糖中的主要单糖。

2.4 脂肪酸含量

表5 3 种灵芝子实体的脂肪酸组成及其相对含量Table 5 Fatty acid compositions of three samples of G. lucidum

由表5可知，3 种灵芝子实体中，均检出14 种脂肪酸，其中饱和脂肪酸8 种，不饱和脂肪酸6 种（包括单不饱和脂肪酸4 种，多不饱和脂肪酸2 种），3 种灵芝子实体的脂肪酸总含量由高到低依次：安徽1号＞吉林2号＞吉林1号。3 种灵芝子实体中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例均超过65%，其中油酸相对含量最高，其次是棕榈酸和亚油酸，这与以往的研究结果[28]相近。安徽1号的油酸和棕榈酸含量最高，而吉林1号和吉林2号的棕榈酸和亚油酸含量相近。

相对于灵芝子实体，灵芝孢子的脂肪酸组成和含量更高，所以以往的研究主要集中在灵芝孢子中。由表5可知，3 种灵芝子实体中的脂肪酸同样以不饱和脂肪酸为主，且油酸相对含量均较高，其次是亚油酸和亚麻酸。油酸、棕榈酸和亚油酸是对人体非常有益的3 种长链不饱和脂肪酸[29]，油酸能抑制低密度脂蛋白的升高和减少高血脂的发生，而亚油酸能促进胆固醇的转运，预防动脉粥样硬化，从而降低心脑血管疾病的发生，亚油酸还具有增强人体抗氧化能力和免疫能力，促进生长发育的作用。亚麻酸是维持大脑和神经系统的必需因子，缺乏亚麻酸会导致人体免疫力降低、疲劳、健忘、视力下降、动脉硬化等症状的发生。灵芝中不饱和脂肪酸的高比例对于其功效有重要意义。

2.5 微量元素含量

表6 3 种灵芝子实体的微量元素含量Table 6 Microelement contents of three samples of G. lucidum mg/kg

由表6可知，在3 种灵芝子实体中，吉林1号的微量元素含量最丰富，除Cu和Zn含量较低外，其他微量元素含量均高于安徽1号和吉林2号，而安徽1号的Cu和Zn含量高于吉林1号和吉林2号。

虽然3 种灵芝子实体微量元素含量均符合国家标准，却存在较大差异，即使是同一省内不同区域的灵芝子实体，微量元素含量也相差较大。7 种主要微量元素中，Ca、Mg、Fe含量在3 种灵芝子实体中含量均较高，这与何晋浙等[18]的研究结果一致。Ca不仅是人体骨骼和牙齿的重要元素，还参与人体多种生命活动，且灵芝中的Ca主要以有机态形式存在，对于我国日常Ca摄入量不足的人群具有重要意义。Fe对免疫功能和生血有重要影响，缺Fe不仅会影响吞噬细胞功能，还会导致贫血。而Mg对于维持细胞的正常代谢和功能发挥起着重要作用，缺Mg会引起包括代谢综合征、高血压、II型糖尿病和冠状动脉硬化型心脏病等多种慢性病。

2.6 灵芝酸含量分析

图2 3 种灵芝子实体灵芝酸A、灵芝酸B的含量Fig. 2 Total contents of ganoderic acid A and B in three samples of G. lucidum

由图2可知，3 种灵芝子实体中灵芝酸A和灵芝酸B含量相差较大，安徽1号灵芝子实体中灵芝酸A和灵芝酸B的总含量（5.62 mg/g）最高，其次是吉林1号灵芝子实体（3.24 mg/g），吉林2号灵芝子实体的总含量（0.51 mg/g）最低。安徽1号的灵芝酸A含量显著大于吉林1号和吉林2号，而安徽1号和吉林1号灵芝酸B含量相近。《药典》（2015版）中规定，采用高氯酸比色法检测灵芝子实体三萜质量分数应不低于0.50%（以齐墩果酸计），而采用比色法测定容易受到灵芝中脂肪酸类成分的干扰，近年来，更多的研究采用高效液相色谱法检测灵芝中的三萜类化合物，精确性显著提高，但测定结果显著低于比色法[30]。

灵芝酸是一类含有羧基的三萜类化合物，主要分为四环三萜与五环三萜，是灵芝中最主要的三萜类物质。自1982年Kubota等首次从灵芝中分离得到灵芝酸A和B以来，已分离到的灵芝酸有100多种，如灵芝酸A、B、C、D、E、F、G、I、L、ma、md、mg等[31]。灵芝酸化学结构复杂，药理活性广泛，具有抗病毒、抑菌、防治心血管疾病、保护肝脏和防治癫痫等功效[32]，被认为是灵芝中与灵芝多糖同样重要的功效活性成分，而日本更是以灵芝酸含量评价灵芝质量的好坏，尤其是灵芝酸A和B，认为其含量越高，质量越好。

3 结 论

灵芝在人工栽培过程中，其子实体化学成分会受到菌种、产区气候、椴木品种，以及采后加工方法等因素的影响。本实验对不同产地、同一产地不同地区灵芝子实体的营养成分和主要活性成分进行分析，结果表明虽然不同产地灵芝子实体化学成分的种类及其含量差异较大，但3 种灵芝子实体均有较高含量的Ca、Mg、Fe三种微量元素，以及较高含量的必需氨基酸和不饱和脂肪酸，而这些成分对于抗疲劳和增强运动能力，以及增强人体的抗氧化能力和免疫能力等都有显著促进作用。多糖是灵芝中主要功效活性成分之一，对调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性均具有显著作用，3 种灵芝子实体的水溶性粗多糖提取率相近，但碱溶性粗多糖提取率却存在着显著差异，且纯化多糖的单糖组成也不同。而3 种灵芝子实体中灵芝酸A和灵芝酸B含量，以及灵芝酸A和B的总含量差异均较大，其中安徽1号含量最高。分析结果为进一步完善灵芝子实体的质量标准，以及根据功效活性制定灵芝质量指标提供技术支持和数据参考。