以合成桔霉素的关键基因为靶标的 PCR检测方法与UPLC法检测红曲中 桔霉素含量的一致性分析

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(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

红曲是以大米为主要原料,经红曲菌(Monascusspp.,也称红曲霉)[1]发酵而成的固态产物。红曲在我国及东南亚地区已有近2千年的应用历史,被广泛用作食品着色剂[2]、防腐剂[3]、发酵剂[4]和中药配伍[5]等,同时也是我国的传统出口产品。但1995年法国学者Blanc首次发现某些红曲菌株能够分泌一种真菌毒素——桔霉素(citrinin,CIT),该物质具有较强的肾脏毒性,还可以致畸、诱发肿瘤、致突变等[6-9],故红曲及其生产菌株的安全性问题备受人们的关注;红曲中的CIT问题也一度成为我国红曲产品出口及新产品开发的限制性因素。日本、韩国制定了红曲色素中桔霉素的限量标准;我国也先后颁布了功能性红曲米[10]和食品添加剂红曲红产品中桔霉素限量标准[11]。因此,如何控制红曲产品中桔霉素含量,使其符合产品标准成为重要的课题。

近年来,国内外学者通过研究得到了一些控制红曲产品中桔霉素含量的有效方法,主要包括低产或不产桔霉素菌株的筛选[12]、发酵条件优化[13-15]以及基因工程改造[16]等方法。在这些方法中,无论是建立新的发酵工艺条件还是改造的基因工程菌均不适合红曲的传统生产工艺要求,因此筛选低产或不产CIT的菌株就成为首选方法,而有效的检测评价方法将会大大减少菌种筛选的工作量。

本研究以25株不同来源的红曲菌为研究对象,考察其基因组中是否含有桔霉素合成的关键基因片段,同时采用免疫亲和柱层析与UPLC结合的方法检测这些菌株在传统发酵工艺条件下制备红曲中桔霉素的含量,探讨菌株中桔霉素合成关键基因存在情况与相应菌株发酵制备红曲中桔霉素含量之间是否具有一致性。研究结果为判断传统发酵工艺生产的红曲产品中桔霉素含量是否符合QB/T 2847-2007功能性红曲米(粉)的桔霉素限量标准(50 μg/kg)提供参考依据,也为评价菌株生产桔霉素的能力提供基本信息。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

25株实验用菌株 为MY1、MY2、MY3、ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH5、JC1、JC2、MG1、MG2、MG3、MF2、MF3、MS1、MS3、GW1、GW2、GW3、GW4、GW5、GW6、GW7、MS2,其中前17株菌株分离自17种不同类型的红曲产品,GW1～GW7购买自荷兰菌种保藏中心(对应的编号分别为CBS 554.76、CBS 302.78、CBS 736.83、CBS 123568、CBS 254.65、CBS 290.34和CBS 291.34),MS2购买自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(对应的编号为AS 3.5838);Easy Taq DNA Polymerase、Trans 2K plus marker和Trans 15K Marker 北京全式金生物有限公司;RNase A、LA Taq DNA Polymerase 宝生物技术(北京)有限公司;桔霉素标准品 阿拉丁公司;常规化学试剂 国药集团化学试剂有限公司。

ACQUITY UPLC H-Class超高相液相色谱仪 美国Waters公司;T960型PCR仪 上海Heal Force公司;DYY-8C型凝胶成像系统 北京六一电泳仪器厂;Neofuge 18R型高速冷冻离心机 上海Heal Force公司;不锈钢五谷杂粮磨粉机 广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 MEA(麦芽提取粉琼脂培养基):麦芽汁提取粉20 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL加热溶解,分装后121 ℃灭菌20 min。

米饭培养基制备:取一定量籼稻米,浸泡3 h沥干,称取50 g沥干后的大米分装于250 mL的三角瓶中,121 ℃灭菌20 min,趁热用手拍打三角瓶至米粒均匀不结块,冷却后备用。

1.2.2 红曲的制备 将菌株接种于PDA斜面上活化,28 ℃培养10 d后,加入5 mL无菌蒸馏水洗孢子,洗出液用三层擦镜纸过滤除去菌丝,玻璃珠振摇打散约10 min,采用血球计数板计数取106个/mL孢子液1 mL接种于制备好的米饭培养基的三角瓶中,混匀,间隔24 h以2 mL/瓶补加无菌水一次,且连续补水3 d,在28 ℃静置发酵12 d,发酵期间观察米粒,如有结块现象,用手拍打三角瓶至米粒均匀不结块。发酵完成后,将其于40 ℃烘干,以磨粉机粉碎并过60目筛,密封,于-20 ℃避光保存,待用。

1.2.3 红曲菌菌株中合成桔霉素关键基因的PCR扩增方法

1.2.3.1 红曲菌基因组提取方法 将少量红曲菌丝接种至铺满玻璃纸的MEA平板上,在28 ℃培养4 d,收集菌丝。取0.4～0.6 g菌丝放入灭菌的研钵中,加液氮迅速研磨成粉末,在粉末融化前以0.2 g/mL的比例加入在65 ℃预热的5% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液,继续研磨至完全混匀,转入无菌离心管,在65 ℃水浴1 h,其间每10 min取出摇匀一次。取出样品,冷却至室温后加入等体积的苯酚/氯仿(1∶1),充分混匀后在12000 r/min离心10 min。转移上清于新的2 mL离心管,加入等体积氯仿,充分混匀后在12000 r/min离心10 min。转移上清于新的2 mL离心管中,加入1/10体积的3 mol/L的NaAc和0.6倍体积的异丙醇,充分混匀后在-20 ℃沉淀30 min以上,在12000 r/min离心10 min。弃上清,沉淀用500 μL 75%乙醇洗涤,在12000 r/min离心5 min,弃上清液,重复洗涤一次。沉淀晾干后加入50 μL的TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)溶解,加5 μL的RNase A(10 mg/mL)37 ℃处理2 h,凝胶电泳检测其质量,4 ℃一个月内短期保存,或-20 ℃数年内长期保存[17-18]。

1.2.3.2 引物设计 本实验以橙色红曲菌桔霉素基因簇序列(EU309474.1)[19]中相关基因为模板,采用Primer 5.0软件设计4对引物,分别针对ctnR、ctnE、pksCT和ctnA基因,又利用已设计引物,组合2对引物,共6对引物[20],相关序列信息如表1所示。

表1 扩增桔霉素相关基因所用引物Table 1 Primers used to amplify citrinin related gene fragments

1.2.3.3 目的片段的PCR扩增 以25种红曲菌基因组DNA为模板,采用1.2.3.2中6对引物对目的DNA片段进行扩增,PCR扩增体系如表2所示,PCR扩增程序如表3所示。

表2 PCR扩增25 μL反应体系组成Table 2 Composition of 25 μL PCR amplification system

表3 PCR扩增程序Table 3 PCR amplification program

1.2.3.4 PCR产物的电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,琼脂糖浓度为1%,电泳仪恒定电压120 V,电泳时间为25 min,采用凝胶成像系统拍照。其中由引物对5～6(表1)扩增的产物,电泳时间为35 min。

1.2.4 桔霉素的检测

1.2.4.1 UPLC测定桔霉素的条件 根据GB 5009.222-2016所示方法对样品进行提取。将收集得到的样品提取液,采用超高效液相色谱(Ultra performance liquid chromategra-phy,UPLC)进行桔霉素检测,使用荧光检测器与二极管阵列检测器(Photo-diode array,PDA),色谱条件:采用Waters 2695液相色谱仪,BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱,流动相为梯度洗脱,流速0.3 mL/min,柱温40 ℃,激发波长331 nm,发射波长500 nm[21]。

表4 流动相及梯度洗脱条件Table 4 Mobile phase and gradient elution conditions

1.2.4.2 标准溶液配制 称取1～3 mg左右CIT固体标准品,甲醇定容至25 mL,作为母液。用UV-Vis分光光度计扫描母液的UV-Vis吸收光谱图,测定在331 nm处的吸光值(摩尔吸光系数ε为5490 L/mol·cm),按照朗伯-比尔定律A=lg(1/t)=εbc,计算CIT母液浓度,并用甲醇稀释至10 μg/mL作为CIT的标准储备液。将母液和储备液密封,4 ℃避光冷藏。配制浓度梯度范围为50～1000 ng/mL的系列CIT标准工作液,应用于UPLC-FLD标准曲线的制作。

1.2.5 试样中桔霉素含量计算 桔霉素含量计算方法参照GB 5009.222-2016,具体如下:

X=ρ×V×f/m

式中:X-试样中桔霉素的含量(μg/kg);ρ-样液中桔青霉素的浓度(μg/L);V-定容体积(mL);f-样液稀释倍数;m-样液所代表的试样量(g)。

2 结果与讨论

2.1 红曲菌桔霉素基因测定结果

根据1.2.3的方法,以橙色红曲菌桔霉素基因簇序列为参照,设计6对PCR扩增引物,以25株红曲菌菌株基因组为模板,分析这些菌株基因组中是否含本实验设计的针对桔霉素合成的关键基因片段。电泳结果如图1(A～F)所示,2、3、7、9、15、16、17、18、19、20、22、23、25号菌株含有6对桔霉素合成相关基因片段的条带,与Marker对照,条带大小符合预期;1、4、5、6、8、10、11、12、14、21、24号菌株不含这些基因片段;13号菌株含有ctnA、pksCT、ctnR+pksCT基因片段,推测可能是ctnR反向引物未能与DNA模板结合,ctnR正向引物可以与DNA模板很好结合,并与pksCT反向引物一起扩增出ctnR+pksCT基因片段。

图1 25种红曲菌的6对引物PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of 25 Monascus strains with 6 pairs of primers注:1～25分别为ZH3、MG3、ZH5、MY2、GW7、GW6、JC2、MY3、MG1、JC1、MY1、MS3、GW4、MS1、MF3、ZH4、GW2、 MS2、MG2、MF2、GW1、GW3、ZH2、GW5、ZH1;A、B、C、D Marker:Trans 2K plus Marker;E、F Marker:Trans 15K Marker。

2.2 桔霉素标准曲线

为了测定红曲中桔霉素的含量,以不同浓度标准品测得峰面积对相应桔霉素质量浓度做线性回归方程为y=1350.5x+6196.1,决定系数为R2=0.9921,检测线性范围在 50～1000 ng/mL。该方法检测桔霉素的仪器检出限为15.92 μg/kg[22]。

2.3 红曲米中桔霉素含量测定结果

根据1.2.4方法,采用UPLC测定25株红曲菌株发酵红曲米中桔霉素的峰面积。根据2.2中桔霉素标准曲线以及1.2.5中的计算方法计算红曲样品中桔霉素含量。检测及计算结果如表5所示。2、3、7、9、15、16、17、18、19、20、22、23、25有桔霉素检出;1、4、5、6、8、10、11、12、13、14、21、24未检出桔霉素。

表5 25株红曲菌发酵红曲中桔霉素的检测结果Table 5 Citrinin content of Hongqu fermented from 25 Monascus strains

2.4 桔霉素合成的关键基因和发酵红曲中是否产生桔霉素的一致性分析

以桔霉素合成的关键基因为靶标进行PCR扩增实验,扩增的结果与UPLC检测菌株发酵红曲中桔霉素的结果进行一致性分析,具体见表6。由表6结果可见,合成桔霉素关键基因的PCR扩增为阳性的菌株,UPLC检测其红曲中桔霉素的含量均超过功能红曲中桔霉素含量不得高于50 μg/kg的限量标准(QB/T 2847-2007),而PCR结果中没有扩增到或没有完全扩增到文中设计的桔霉素合成关键基因片段的,桔霉素含量均低于仪器检出限15.92 μg/kg,

表6 PCR扩增与UPLC检测结果的一致性分析Table 6 Consistency analysis between PCR amplification and UPLC detection results

续表

远低于QB/T 2847-2007功能性红曲米(粉)的桔霉素限量标准。结果表明，菌株是否含有合成桔霉素关键基因与其发酵红曲中桔霉素含量是否超标具有一致性。

3 结论

不同来源的25株红曲菌,以其桔霉素合成的关键基因为靶标,设计6对引物进行PCR扩增实验。扩增的结果与UPLC检测菌株发酵红曲中桔霉素的结果进行一致性分析,探讨二者之间的相关性。实验表明，PCR扩增结果与UPLC检测结果具有一致性,即菌株是否含有合成桔霉素关键基因与传统发酵工艺下生产的红曲中桔霉素含量是否超标具有一致性。因此,可以采用本实验设计的PCR方法作为判断传统发酵工艺条件下红曲产品中桔霉素含量是否超标的方法,该方法简单、快速,大大节约了检测时间和检测成本;同时,也为了解不同红曲菌株分泌桔霉素的能力提供了基本信息。