VB2脂质体的制备、表征及其稳定性

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(1.湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430068; 2.福格森(武汉)生物科技股份有限公司,湖北武汉 430056)

脂质体(Liposomes)是由磷脂双分子层组成的分子组装体,具有类似生物膜的闭合囊泡结构,可荷载亲水和疏水性成分,亲水性成分可被包封于水相囊泡中,疏水性成分可被截留于磷脂双分子层中[1-5]。脂质体具有良好的分散性、生物相容性及安全性,可用于矿物质、维生素、抗氧化剂等功能成分的包载。在不利环境下脂质体可起到缓冲作用,从而保护芯材免受外界环境的影响[6-9]。脂质体作为营养组分包载体系已引起食品领域的广泛关注,Cuomo等[10]利用脂质体荷载姜黄素,通过体外消化模型发现其可显著提高姜黄素的生物利用率。王坤[11]将脂质体包覆巯基化壳聚糖后形成的稳定化脂质体与β-甘油磷酸钠进行交联,制备得到脂质体水凝胶,结果表明水凝胶的生物相容性随脂质体含量的增加而增强。

VB2(Vitamin B2)又称核黄素,可促进生长发育和细胞的再生,帮助人体预防和消除口腔内、唇、舌及皮肤的炎症,是人和动物维持机体正常结构与功能的必需营养物质[12-14]。在光照及紫外照射下会产生日光臭味,易受光、热、金属离子等因素影响,使其应用受到了限制[15]。目前市场上VB2补充剂多为片剂,不仅无法掩蔽VB2自身的异味,且在人体胃肠道中易受消化液或食物中其他物质的破坏,使其在人体内的生物利用率降低[16]。本文采用脂质体包载VB2,确定了VB2脂质体的制备参数,并探究脂质体对VB2不良气味掩蔽的效果及其胃肠稳定性,为VB2的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆卵磷脂 美国Sigma-Aldrich公司;胆固醇 国药集团化学试剂有限公司;VB2武汉盛世天元生物科技有限公司;吐温80(Tween 80) 国药集团化学试剂有限公司;磷钨酸混合物 上海麦克林生化科技有限公司;胃蛋白酶(酶比活力:1∶3000) 上海麦克林生化科技有限公司公司;胰蛋白酶(酶比活力:1∶4000) 上海源叶生物科技有限公司;超纯水 MILLIPORE-Q,美国Merck llipore公司;其余常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

Zetasizer Nano-ZS纳米粒度及电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司;MODUL YOD-230真空冷冻干燥机 美国Thermo公司;VCX 800超声波细胞粉碎仪 美国SONICS公司;F-7000荧光分光光度计 日本日立公司;DELTA 320pH计 瑞士梅特勒-托利多公司;R-3旋转蒸发仪 瑞士步琦有限公司;Tecnai G2 20透射电子显微镜 荷兰FEI公司;FOX 4000电子鼻 法国阿尔法莫斯仪器有限公司;Direct Q3超纯水机 美国默克密理博(Merck Millipore)公司;HJ-8A磁力搅拌器 武汉科尔仪器有限公司;KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 VB2脂质体制备 VB2脂质体的制备参考Lasic[17]的制备方法,并在其基础上进行改进。按一定比例精确称取卵磷脂、胆固醇,溶于30 mL无水乙醚中,按3∶1 (v/v)加入一定浓度的VB2水溶液,混匀后置于冰水浴中利用超声波细胞粉碎仪超声(800 W,40%,超声3 s,关1 s)5 min得到均一的乳液。将乳液于35 ℃、0.1 MPa的条件下减压旋蒸40 min除去有机溶剂,待瓶中形成凝胶状物后,继续旋转蒸发至凝胶塌陷。然后加入40 mL pH7.0的磷酸缓冲溶液和一定比例的Tween 80旋蒸30 min,得到VB2脂质体混悬液,在温度为-47 ℃,真空度为15 Pa下冷冻干燥36 h后得到VB2脂质体冻干粉末。

1.2.2 VB2脂质体制备条件的确定

1.2.2.1 胆固醇与卵磷脂质量比(r(C/P))的确定 根据1.2.1中方法制备VB2浓度为0.8%,卵磷脂质量比r(T/P)为4∶5,r(C/P)分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的VB2脂质体,对其粒径、ζ-电位以及包封率进行测定(见1.2.3、1.2.4),选择最适r(C/P)值。

1.2.2.2 Tween 80与(r(T/P))的确定 根据1.2.1中方法制备VB2浓度为0.8%,r(C/P)为1.2.2.1中检测到的最佳比例,r(T/P)分别为1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5的VB2脂质体,对其粒径、ζ-电位以及包封率进行测定,选择最适r(T/P)值。

1.2.2.3 VB2浓度的确定 根据1.2.1中方法制备r(C/P)及r(T/P)为1.2.2.1与1.2.2.2中的最佳比例,VB2浓度分别为0.4%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的VB2脂质体,对其粒径、ζ-电位以及包封率进行测定,选择最适VB2浓度。

1.2.3 VB2脂质体粒径及ζ-电位测定 采用纳米粒度及电位分析仪测定1.2.2中优化的最佳工艺下制得的VB2脂质体混悬液粒径分布及ζ-电位。测定前先将混悬液轻微振荡摇匀,样品测定时,温度25 ℃,折光指数1.33,分散相折光指数1.47,吸光指数0.01,He-Ne激光光源输出功率4 mW,检测角度173 °,检测波长633 nm。

1.2.4 VB2脂质体包封率测定

1.2.4.1 标准曲线及VB2脂质体包封率计算 在室温下利用荧光分光光度计,分别测定浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的VB2标准溶液的荧光强度,绘制标准曲线。获得标曲为y=18.473x+3.663(R2=0.9943,x:VB2浓度,μg/mL,y:荧光强度值)计算VB2脂质体中VB2的总质量及脂质体表面VB2质量,并按式(1)计算脂质体的包封率。

包封率(%)=(P2-P1)/P2×100

式(1)

其中:P1表示脂质体表面VB2的质量;P2表示脂质体中VB2的总质量。

1.2.4.2 脂质体表面VB2质量测定 室温下准确称取20～30 mg VB2脂质体干样品加入20 mL无水乙醇中,100 r/min下磁力搅拌2 min后进行过滤,收集滤液。将滤液于30 ℃、0.085 MPa真空度下进行减压蒸馏,直至无水乙醇完全挥发,瓶壁内侧形成一薄层脂质膜,向瓶中加入6～7 mL三氯甲烷洗下瓶中的脂质膜,得到混合溶液。然后向混合溶液中加入15 mL超纯水以萃取溶液中的VB2,静置1 h后收集上层溶液,萃取过程重复三次,合并每次萃取后得到的水层(上层)溶液,并用超纯水定容至50 mL。取3 mL溶液测定其荧光强度,根据标准曲线计算脂质体表面VB2质量。

1.2.4.3 脂质体中VB2总质量测定 室温下准确称取20～30 mg VB2脂质体干样,加入6～7 mL三氯甲烷,待样品溶解后加入15 mL超纯水萃取溶液中的VB2,静置1 h然后收集上层溶液,萃取过程重复三次,合并每次萃取后得到的上层(水层)溶液,并用超纯水定容至50 mL。取3 mL溶液测定其荧光强度,根据标准曲线计算脂质体中VB2质量。

1.2.5 VB2脂质体微观形貌观察 将1.2.2中优化的最佳工艺下制得的VB2脂质体冻干粉利用蒸馏水制备VB2脂质体混悬液,在室温下用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液将其浓度稀释至0.02%(w/w),在数控超声波清洗装置中以24 kHz超声处理10 min,促进样品分散,然后用移液枪吸取20 μL样品滴至铜网正面,室温下风干,随后用毛细吸管取1%(w/w)磷钨酸(水浴超声1 h,32 kHz,0.22 μm水相滤膜过滤)滴至样品表层,再次室温风干后,利用透射电子显微镜进行观察。

1.2.6 VB2脂质体对VB2气味掩蔽能力测定 采用电子鼻评价脂质体对将1.2.2中优化的最佳工艺下制得的VB2脂质体不良气味的掩蔽效果检测。准确称取1.00 g VB2脂质体冻干粉末于20 mL电子鼻专用顶空瓶中,同时分别以未荷载VB2脂质体冻干粉末和VB2原料粉末作为对照组进行实验,采用聚四氟乙烯隔垫进行密封,置于自动进样装置上,加热箱温度40 ℃,每个样品加热2 min,振荡速度500 r/min。测定时以合成的干燥空气为载气,流速150 mL/min,进样针温度50 ℃,注射体积2.5 mL,注射速度2.5 mL/s,获取时间2 min,延滞时间5 min。每个样品在上述条件下重复分析4次。

1.2.7 VB2脂质体胃肠稳定性实验 模拟胃液的配制:于室温下准确取浓盐酸14 mL,氯化钠4.00 g,胃蛋白酶6.40 g加入1800 mL纯水中,充分混合后,调节溶液pH至1.3并定容至2 L。模拟肠液的配制:于室温下准确称量13.06 g磷酸二氢钾溶于1 L纯水中后,再加入12.70 mL 6 mol/L氢氧化钠溶液,20.00 g胰蛋白酶和5.00 g胆盐,充分溶解后调节溶液pH至7.5并定容至2 L[18]。移取2 mL蒸馏水制备的VB2脂质体混悬液于透析袋中,浸没于100 mL模拟胃肠液中,在37 ℃下以100 r/min转速搅拌,分别在1、2、3、4、5、10 h测定VB2体外释放量。

1.3 数据处理

采用SPSSV 21.0软件进行显著性分析,所得数据为三次重复(n=3),数据采用M±SD表示,两组数据间显著性差异表示为p<0.05,采用Excel 2.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 VB2脂质体制备条件的确定

2.1.1 不同r(C/P)对VB2脂质体的影响 在磷脂双分子层中,胆固醇如“缓冲剂”一般起着调节膜结构“流动性”的作用,胆固醇的羟基可与磷脂分子的羟基通过氢键结合形成复合物,使磷脂分子间结合更为紧密,增加脂质体的稳定性[5]。由图1可知,VB2脂质体粒径均为单峰分布,当r(C/P)为1∶10、1∶8、1∶4和1∶2时,VB2脂质体粒径分布范围较窄,呈现出良好的分散性和稳定性。

图1 不同r(C/P)对VB2脂质体粒径分布的影响Fig.1 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different r(C/P)

由表1可知,在r(C/P)为1∶6、1∶8、1∶10条件下制得的VB2脂质体包封率较高且无显著差异(p>0.05),其中r(C/P)为1∶8时,VB2脂质体的ζ-电位最大,为-19.4 mV。有研究表明,微粒所携带的电荷量多,可提供斥力防止微粒间发生聚集[17]。当r(C/P)为1∶8时,VB2脂质体带有较强负电,粒子之间存在一定静电排斥力,脂质体微粒可均匀分散于体系中,保持体系的稳定。通过综合考虑VB2脂质体粒径、电位及包封率,选择r(C/P)为1∶8进行下一步实验。

表1 不同r(C/P)VB2脂质体的ζ-电位及包封率Table 1 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2in different r(C/P)

2.1.2 不同r(T/P)对VB2脂质体的影响 Tween 80作为非离子型表面活性剂,加入脂质体中可增加脂质体的稳定性。由图2知,与r(T/P)为2∶5相比,r(T/P)为3∶5和4∶5时,VB2脂质体粒径分布范围较窄,且呈单峰分布,有利于维持纳米脂质体悬浮液体系的稳定性[19]。存在于脂质体双分子层中Tween 80的聚氧乙烯基可从脂质双层中伸出,致密覆盖在双层表面,在脂质体外表面形成有一定厚度的亲水相,促进脂质体曲率的增加,因而得到粒径较小的脂质体,但当Tween 80浓度较小时,部分VB2脂质体中Tween 80含量较少,从而导致体系中脂质体粒径不均一[20]。

图2 不同r(T/P)对VB2脂质体粒径分布的影响Fig.2 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different r(T/P)

如表2所示,不同r(T/P)下VB2脂质体所带负电荷随Tween 80浓度增加而减小,研究表明,脂质体的ζ-电位受脂质类型、芯材等影响,电荷变化表明芯材进入磷脂双分子层中,而电位的下降可能是由于表面活性剂的加入改变了粒子的剪切平面所导致的[21-23]。

表2 不同r(T/P)下VB2脂质体的ζ-电位及包封率Table 2 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2in different r(T/P)

表2可知,VB2脂质体包封率随Tween 80含量的增加呈现出增大的趋势,但当Tween 80添加比例超过3∶5时,脂质体的包封率下降。可能是脂质体中存在的亲脂性基团引起脂质体表面“稠化效应”的增强,使膜的有效厚度增加,为VB2提供了良好的存在空间,从而保持较高包封率,但当Tween 80浓度超出一定范围后,过量的Tween 80造成脂质膜双分子层结构的破坏,导致包封的VB2泄漏,降低了包封率[18]。因此为保证VB2脂质体体系的稳定性及脂质体双分子层结构的完整性,选择r(T/P)为3∶5进行下一步实验。

2.1.3 不同VB2浓度对VB2脂质体的影响 由图3可知,VB2浓度为1.0%、0.8%时制得的VB2脂质体粒径分布为单峰分布,脂质体在体系中分散均一。而当VB2浓度为0.4%、1.5%、2%时,脂质体的粒径分布为双峰分布,可能是由于当VB2浓度为0.4%时,体系中VB2浓度较低,导致体系中形成的部分脂质体未荷载VB2,体系中存在已荷载VB2和未荷载VB2两种脂质体;当VB2浓度为1.5%和2%时,体系中VB2含量过高,壁材/芯材比减小,壁材所产生的物理阻隔或屏障作用减小,部分VB2脂质体中包载的VB2易泄露到脂质体表面,导致脂质体颗粒大小不均一[24]。

图3 不同VB2浓度对VB2脂质体粒径分布影响Fig.3 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different concentration of VB2

如表3所示,不同VB2浓度下脂质体电位无显著差异(p>0.05),而包封率随VB2浓度增加而增加,可能是由于体系中芯材浓度增大,使得脂质体囊泡对目标物捕捉更加容易,因而包封率增大[18]。VB2浓度1.0%时,所制备的VB2脂质体在体系中分散均匀,具有良好的稳定性较高的包封率,其ζ-电位为-12.1 mV,包封率为94.67%。

表3 不同VB2浓度下VB2脂质体的ζ-电位及包封率Table 3 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2 in different concentration of VB2

2.2 VB2脂质体形貌

如图4可知,荷载1.0% VB2的脂质体大小均一,呈规则球形结构且分散均匀,其粒径较大约为300～500 nm,而荷载2.0% VB2的脂质体粒径较小,呈现不规则状并有聚集趋势,可能是由于2.0% VB2浓度过高,体系中过量的VB2不能被脂质体水相囊泡截留,且其壁材/芯材比较1% VB2浓度下的壁材/芯材比小,导致其壁材的物理阻隔作用减小,使脂质体内部的部分VB2泄漏。

图4 不同VB2浓度的脂质体的TEM图(7000×)Fig.4 TEM observation of liposomes in different concentrations of VB2(7000×)注:A:0%;B:1.0%;C:2.0%。

2.3 VB2脂质体的气味分析

如图5,利用电子鼻对获得的VB2脂质体样品的信号数据进行主成分分析,建立前2个主成分的二维判别图。由图5A可知,VB2脂质体平行检测的数据可构成独立组群,表明电子鼻分析检测重现性好。经主成分分析,发现VB2脂质体的主成分PC1和PC2的累积方差贡献率为96.70%,大于85%,说明PC1和PC2包含信息量大,能够反映VB2脂质体的整体信息[25-26]。区分指数(discrimination index,DI)为电子鼻软件提供样品区分程度的表征值,该值与区分效果呈线性相关,最大值为100,本实验中DI值为91,表明区分有效[27]。图5A中VB2脂质体和VB2原料分布区域较远,说明VB2脂质体与VB2原料在气味上差别明显,即VB2脂质体可成功掩蔽VB2的不良气味。

图5B清晰显示出VB2脂质体对18个传感器的反应信号强度具有不同的响应。其中VB2脂质体与VB2原料存在明显差异,7种传感器(T40/2、P30/2、P40/2、P30/1、PA/2、T70/2、T30/1)响应值的差异明显,表明脂质体成功掩盖了原料VB2不良气味[28]。通过建立样品指纹图,可对VB2的不良气味掩蔽提供理论依据,为设计含VB2的食品配方提供了新思路。

图5 VB2脂质体电子鼻气味分析Fig.5 Anylyse of liposomes loaded with VB2 by E-nose注:A:VB2脂质体主成分分析; B:VB2脂质体指纹图每组样品做4个平行。

2.4 VB2脂质体模拟胃肠液体系下的稳定性

如图6,在模拟胃液中,前2 h内VB2脂质体的释放率小于7.0%,4 h VB2释放率增加至33.1%。可能由于在胃液低pH环境中,高浓度H+穿过脂质双分子层膜,导致双分子层膜的渗透性增加,脂质体失稳,被截留在脂质体水相的VB2更容易透过双分子膜[29]。在人工模拟肠液中,前2 h内VB2脂质体的释放率约为10.3%,4 h VB2的释放率增加至49.2%。可能是由于模拟肠液环境中的胆盐会破坏脂质体的双分子层膜,促使VB2释放[18]。

图6 VB2脂质体在模拟胃肠液体系下的释放率Fig.6 Releaserate of liposomes loaded with VB2 under simulated gastrointestinal fluid system

3 结论

本文优化了VB2脂质体制备工艺,并对其在模拟胃肠液中的稳定性及对VB2不良气味的掩蔽进行评价。结果表明,当r(C/P)=1∶8,r(T/P)=3∶5,VB2浓度为1.0%时制备的VB2脂质体ζ-电位为-12.1 mV,包封率为94.67%,微粒形态规整,分散均匀。经过脂质体包封能够实现对VB2不良气味的掩蔽,且VB2在体外模拟胃肠液中呈缓慢释放。本研究基于食品结构化设计理论,构建了不稳定营养素VB2的递送体系,改善了VB2的不良感官特性,为设计含VB2的食品配方提供一定的理论依据。