花青素共价交联大豆蛋白 对其表面疏水性及功能性的影响

,,,,, ,,

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

食品是多成分共存的复杂体系,体系中不同成分之间的相互作用会影响食品的结构、功能、营养等。在食品体系中,食物多酚和蛋白是两种常见的物质[1]。同时,两者还是食品工业中非常重要的天然食品添加剂,所以食物多酚和蛋白的互作已经逐渐成为学者们的研究热点[1]。黑米中的花青素就是一种常见的食物多酚,属于黄酮类化合物,是人类饮食中重要的营养成分[2]，其具有多种对人体有益的功能特性,有助于预防心脏病、炎症、癌症等疾病[3-5]。花青素作为多酚类小分子,对蛋白具有较高的亲和力,可与蛋白大分子产生交互作用。SPI是一种公认的全价植物蛋白,具有丰富的营养性和功能性,在食品行业中受到了广泛青睐[6]。科学研究表明,在食品加工过程中,SPI也会不可避免的受到食品体系中其他成分的影响,例如食物多酚、多糖等[7]。

多酚与蛋白在不同加工条件下可发生非共价作用或共价交联[1]。其中非共价作用主要包括氢键、范德华力、π键、疏水作用和离子相互作用等作用类型[8]。共价交联主要依靠形成化学键来实现:多酚经过化学碱法处理(pH9)或生物酶法处理(pH7,多酚氧化酶)可被氧化形成醌类物质,其醌类物质可与蛋白多肽链的氨基酸残基形成稳定的化学键[9]。目前李杨等[7]人已经对花青素与SPI的非共价复合体系及化学碱法处理得到共价交联复合物进行了结构与界面功能的探究。研究发现,SPI中花青素的引入改变了蛋白的结构,并使蛋白界面功能(起泡性/乳化性)有所改善。Jia等[10]研究发现儿茶素和乳清分离蛋白在碱性条件下可发生共价交联,且两者之间的共价交联改善了乳清分离蛋白的发泡和乳化性能。Prigent等[11]利用化学碱法和生物酶法分别共价交联绿原酸与牛血清蛋白、α-乳白蛋白和溶菌酶,结果表明两种共价交联方式都使蛋白的溶解性、热稳定性及起泡性发生了改变。

尽管已有文献对多酚与蛋白互作体系的功能性质进行了部分探究,但是目前文献多集中于研究蛋白与多酚的单一互作,关于多酚与蛋白在不同共价交联处理下所形成复合体系的功能性质探究相对较少,尤其是花青素与大豆分离蛋白。由此,本文选用不同浓度的花青素分别利用生物酶法和化学碱法对大豆分离蛋白进行交联,探究在不同共价交联条件下,不同浓度的花青素对蛋白功能的影响规律,以期拓宽大豆蛋白的应用领域,实现大豆蛋白在食品中更大的利用价值,以期生产出多功能的蛋白产品,为食品中大豆蛋白的合理应用提供重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆、葵花油 市售;大豆分离蛋白 实验室自制;黑米花青素提取物 中国山西天之润生物科技有限公司;漆酶(3000 U/g) 河北仟盛生物科技有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇、乙酸乙酯 科密欧化学试剂有限公司;正己烷、盐酸、氢氧化钠、1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS) 天津北科化学品有限责任公司;其他化学试剂 均为分析纯。

SPD-M20A液相色谱仪 日本岛津公司;C18反向色谱柱(250 mm×4.6 mm,Sunfire) 美国 Waters 公司;Mastersize 2000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司;Tecan Infinite 200 Pro 酶标仪 瑞士帝肯公司;ZetaPALS-Zeta电位仪 美国布鲁克海文仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆分离蛋白的制备 参考江连洲等[12]的制备方法。将大豆去皮粉碎,过60目筛网,将筛选后的豆粉与正己烷(1∶3,w/v)混合,进行3次脱脂(每次离心条件为15 min,25 ℃,4500×g),得到的脱脂豆粉溶解于去离子水(1∶20,w/v)中,用NaOH(2 mol/L)调节混合溶液的pH至8,经室温下搅拌2 h后,使其悬浮液在4 ℃,10000×g的条件下离心20 min,取上清液并用HCl(2 mol/L)调节pH至4.5,将上清液静置1 h后在4 ℃,6000×g下离心20 min即得蛋白沉淀物,沉淀经3次去离子水水洗后溶解,用NaOH(2 mol/L)调节蛋白溶液至pH7后冷冻干燥,即可得SPI粉末。

1.2.2 花青素的提纯与定量分析 参考本实验团队前期实验成果的方法[13]对黑米花青素提取物进行提纯,用去离子水溶解黑米花青素提取物后除杂。将除杂后的溶液通过固相萃取柱使其花青素吸附,随后依次用酸化水(2倍柱体积)洗脱不溶性杂质,乙酸乙酯溶液(2倍柱体积)洗脱多酚类杂质(酚酸、黄酮等),酸化的甲醇(4倍柱体积)洗脱吸附柱上吸附的花青素。将所得溶液在40 ℃的条件下旋转蒸发以去除甲醇,得到纯化的花青素。用高效液相色谱法(HPLC-DAD)对纯化后的花青素进行定量分析[13]。本文统一采用近似处理,用矢车菊素-3-葡萄糖苷浓度(黑米花青素主要成分)代替花青素浓度(除杂后的溶液中花青素的纯度纯度为93%。标准曲线方程为:y=0.0000000132x-0.0006136772,其中x为面积,y为浓度,R2=0.9977)。

1.2.3 SPI与花青素共价聚合物的制备

1.2.3.1 生物酶法 依据Prigent等[14]的方法,并将其稍作修改。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS,pH7)溶解大豆分离蛋白使其浓度为1%(w/v),随后分别加入花青素使其最终浓度为0.017%、0.025%、0.05%(w/v),最后添加漆酶(0.2 U/mL)黑暗条件下搅拌24 h。

1.2.3.2 化学碱法 参照Rohn等[15]的方法,用0.01 mol/L PBS溶解大豆分离蛋白使其浓度为1%(w/v),添加不同浓度(0.017%、0.025%、0.05%,w/v)的花青素后,调节溶液pH为9.0,黑暗条件下搅拌24 h。将6组反应后的样品进行透析(截留分子量8～10 kDa),时长48 h,期间每隔8 h换一次水。冻干透析袋内样品,经本实验团队在前期的研究,证实此样品为共价交联复合物,放入干燥器,备用。

1.2.4 表面疏水性的测定 参考王中江等[16]的方法稍加修改,应用疏水性荧光探针ANS测定SPI和SPI-花青素共价复合物的表面疏水性。用PBS(0.01 mol/L,pH7.0)溶解样品至浓度为1 mg/mL,将其在9000×g离心10 min获取上清液。使用Lowry法测定上清液的蛋白浓度后,将上清液稀释以得到梯度浓度的上清液溶液。将所得梯度的上清液溶液与8.0 mmol/L ANS以100∶1 (v/v)混合,3 min后用酶标仪测定溶液的荧光强度,其中激发波长为390 nm,发射波长为468 nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图,曲线的初始斜率即样品的表面疏水值S0。

1.2.5 起泡性及起泡稳定性的测定 参照Sui等[17]的方法测定样品的起泡性及起泡稳定性。用PBS(0.01 mol/L,pH7)溶解样品至蛋白浓度为1%(w/v),记录样品溶液体积V。将样品溶液在13400 r/min下均质1 min,记录初始泡沫体积V0,在室温下静止15,30 min并分别记录其泡沫体积V15和V30。其起泡性和起泡稳定性计算方程为式(1)、式(2):

式(1)

式(2)

1.2.6 乳化性及乳化稳定性的测定 参考Liu等[18]的方法稍作修改。用PBS(0.01 mol/L,pH7.0)溶解样品至蛋白浓度为0.1%(w/v),将样品溶液与葵花油以3∶1 (v/v)的比例混合后于10000 r/min下均质1 min,取其底部乳液50 μL与4.95 mL 0.1%的SDS溶液混匀。随后用紫外分光光度计在500 nm处测定样品的吸光度值A0,用相同浓度的SDS溶液作为空白对照。静置10 min后再次测量其吸光度值A10。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)根据式(3)和式(4)进行计算:

式(3)

式(4)

式中,DF为稀释倍数(100);C为蛋白的浓度,g/mL;φ为比色皿的光程(1 cm);θ为乳化液中油相体积分数。

1.2.7 ζ-电位的测定 用PBS(0.01 mol/L,pH7.0)溶解样品至0.2 mg/mL后,使用Zeta电位分析仪对SPI和SPI-花青素共价复合物进行ζ电位测定。

1.2.8 粒径分布的测定 参考江连洲等[19]的方法使用激光粒度仪对SPI和SPI-花青素共价复合物进行粒径分布测定。其中颗粒折射率为1.46,分散剂折射率为1.33,吸收参数为0.001。

1.3 数据处理

每组数据至少重复3次,利用Origin 8.0软件作图。利用SPSS V22.0软件进行ANOVA差异显著性分析及相关性分析(p<0.05为显著性差异)。

2 结果与讨论

2.1 表面疏水性分析

ANS是一种广泛使用的荧光“疏水性探针”,用于检测蛋白质的非极性特性。它可以通过分析蛋白质的亲水/疏水特性变化对蛋白质的构象给予研究[20]。因此,本文使用ANS来测定天然SPI和花青素-SPI共价复合物的表面疏水性。表面疏水性作为蛋白的结构特性,对蛋白的功能性质具有很大的影响,是衡量蛋白质功能性质的关键指标之一[21]。如图1所示,花青素对SPI的共价交联致使SPI的表面疏水性显著性下降(p<0.05),且随着添加的花青素浓度越高,SPI的表面疏水性越低。尤其是添加花青素浓度为0.05%时,相较于天然SPI,酶法和碱法交联的花青素-SPI共价复合物表面疏水性分别减少了87.71%和82.71%。这意味着SPI中花青素的共价引入使得SPI的表面呈现出更加亲水性的特性,蛋白质表面的疏水向亲水特性变化表明花青素对SPI的共价交联使得SPI的结构发生了改变[22]。SPI表面疏水性下降的原因可能是在多酚氧化酶和碱性条件下,花青素可以被氧气分子氧化形成花青素醌,花青素醌可以和蛋白质多肽链上的氨基酸残基发生亲核反应,由于两者特定的结合位点(例如色氨酸残基)使得蛋白的疏水基团减少,因而使得蛋白表面呈现出更加亲水性的特征。同时,由于花青素与SPI的共价交联改变了SPI的结构构象,一定程度会导致蛋白掩埋的部分亲水区域暴露,这可能也是SPI交联花青素后表面疏水性降低的一个原因[23]。同样的结果在β-乳球蛋白和咖啡酸的共价相互作用中被发现:咖啡酸对β-乳球蛋白的交联导致蛋白的表面疏水性降低[9]。

图1 花青素-SPI共价复合物的表面疏水性Fig.1 Surface hydrophobicity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

2.2 起泡性及起泡稳定性分析

蛋白质的起泡性和起泡稳定性是决定蛋白质在食品工业中应用的重要功能性质[24]。图2展示了SPI在交联花青素前后的起泡性及起泡稳定性。如图2所示,花青素对SPI的共价交联显著地改善了SPI的起泡性(p<0.05)。而且,在同一种共价交联方式下,添加的花青素浓度与SPI的起泡性成正比。就起泡稳定性来看,共价条件下SPI中花青素的引入使得蛋白的起泡稳定性有所升高。尤其是花青素浓度为0.05%时,相较于SPI,LC3和AC3在30 min的起泡稳定性显著升高了75.49%和37.03%(p<0.05)。而且,随着花青素浓度的升高,SPI的起泡稳定性也逐渐增加。这与田梅等[25]探究茶多酚与SPI的相互作用结果一致,研究表明一定浓度的茶多酚可以改善SPI的起泡性能。另外,由图可知:在添加同浓度的花青素时,酶法交联的花青素-SPI共价复合物比碱法交联的复合物具有更高的起泡性和起泡稳定性。这说明,花青素对SPI的共价交联可以改善SPI的起泡性和起泡稳定性,而酶法交联比碱法交联对SPI的改善效果更加明显。蛋白质泡沫的形成基于蛋白质迅速移动到空气/液体界面的能力,其能够使蛋白质结构在界面处得到重新排列,然后通过部分展开的蛋白质结构降低表面张力,从而在空气/液体界面形成具有弹性的膜-气泡[24,26]。由之前关于花青素与SPI的共价探究分析可知,花青素与SPI的共价交联可以改变蛋白质的结构,花青素-SPI共价复合物的结构可能会更有效的降低表面张力,从而使复合物在空气/液体界面形成更多具有弹性的气泡,进而使得花青素-SPI共价复合物比SPI具有更好的起泡性和起泡稳定性,而在生物酶法条件下的花青素-SPI共价复合物的结构则可能降低表面张力更有效,因此酶法交联比碱法交联对SPI的改善效果更加明显[12,27-28]。

图2 花青素-SPI共价复合物的起泡性和起泡稳定性Fig.2 Foaming properties and foaming stability of SPI and anthocyanins-SPI conjugates注:所有样品均测定3次取平均值,同一指标 标注不同字母代表样品间差异显著(p<0.05)；图3、图4同。

2.3 乳化性及乳化稳定性分析

蛋白质的乳化性能可以用乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)来表示。EAI是指蛋白质快速吸附在油滴表面以形成油水界面并使其稳定的能力;ESI是指乳液抵抗分离并保持分散的能力[29]。如图3所示,与天然SPI相比,花青素-SPI共价复合物的EAI和ESI都显著性升高(p<0.05)。另外,除了LC2,无论是生物酶法还是化学碱法交联的共价复合物,样品的乳化性和乳化稳定性都与添加的花青素浓度成正比。这表明花青素对SPI的共价交联可以明显改善SPI的乳化性和乳化稳定性,并且在一定浓度范围内,SPI中交联的花青素越多,SPI的乳化性和乳化稳定性越好。这主要是因为蛋白质在快速吸附油滴表面时,花青素的添加可以增强SPI降低油相和水相之间界面张力的能力,进而形成更稳定的界面膜,从而形成的乳液拥有更高的乳化性[10]。另外,蛋白与花青素共价交联后,乳液乳化稳定性上升,其原因可能是液滴间空间斥力的增加及表面电荷的变化。类似的结果Jia等[30]在乳清分离蛋白和儿茶素的共价相互作用中也有所发现,研究表明儿茶素与乳清分离蛋白的共价相互作用可以改善乳清分离蛋白的乳化性和乳化稳定性。当添加同浓度的花青素时,生物酶法交联的花青素-SPI共价复合物比化学碱法交联的复合物拥有更高的乳化性和乳化稳定性。这表明添加的花青素定量时,生物酶法比化学碱法对SPI的改善能力更强。

图3 花青素-SPI共价复合物的乳化性和乳化稳定性Fig.3 EAI and ESI of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

2.4 ζ-电位分析

溶液粒子之间的相互作用力可以用ζ-电位的绝对值来表征,从而可以测定溶液体系的稳定性。一般来说,越稳定的溶液体系拥有越高的ζ-电位的绝对值,此时溶液粒子之间具有很强的相互排斥力,比较不容易碰撞而发生聚集[19]。图4展示了生物酶法和化学碱法条件下SPI与花青素-SPI共价复合物的ζ-电位分析图。由图4可知,相较于天然SPI的溶液体系,花青素-SPI共价复合物溶液具有更高的ζ-电位绝对值。随着花青素浓度的升高,复合物溶液的ζ-电位绝对值也逐渐升高。而除了LC1和AC1外,添加同浓度花青素时,酶法交联的花青素-SPI共价复合物溶液具有比碱法条件下的复合物溶液更高的ζ-电位绝对值。尤其是LC3,ζ-电位绝对值比天然SPI溶液和AC3溶液分别高了64.35%和10.98%(p<0.05)。这意味着花青素-SPI共价复合物溶液比未添加花青素的SPI溶液具有更高的稳定性,并在一定浓度范围内,添加的花青素浓度越高,花青素与SPI形成的溶液越稳定。当添加同浓度且浓度较高的花青素时(例如LC2和AC2,LC3和AC3),生物酶法交联的花青素-SPI共价复合物溶液具有比化学碱法交联的复合物溶液更高的稳定性。这主要是因为,花青素在多酚氧化酶和碱法条件下氧化形成的醌类物质带负电荷,可以与SPI正电基团结合,从而使得蛋白的负电荷相对增加。而添加相同且较高浓度的花青素时,生物酶法条件下SPI交联的花青素醌要多于化学碱法,所以蛋白的负电荷相对增加的更多,也就具有更高ζ-电位绝对值[19]。

图4 花青素-SPI共价复合物的ζ-电位Fig.4 ζ-potential values of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

2.5 粒径分布分析

生物酶法和化学碱法交联的SPI-花青素共价复合物与天然SPI的粒径分布由图5A,图5B可知。天然SPI溶液粒径分布呈现三个峰,溶液液滴直径在0.5～1 μm的相对体积最多。花青素对SPI进行交联后,共价复合物溶液呈现出双峰或单峰分布,这说明与天然SPI溶液相比,花青素-SPI共价复合物溶液液滴具有更加相似的直径,其溶液的稳定性更强[19]。就图5A来看,SPI引入花青素后,在生物酶法的条件下,形成的溶液液滴直径在0.01～0.8 μm的相对体积居多。尤其是LC3,溶液液滴直径在0.01～0.1 μm的相对体积占据最多。而随着添加的花青素浓度的升高,复合物LC1、LC2、LC3复合物溶液的相对体积占据最多的粒径越来越小。这可能是因为花青素与SPI共价交联后使SPI溶液的ζ-电位绝对值升高,有助于保持溶液粒子之间彼此远离,从而导致更小的溶液液滴尺寸[16]。图5B表明出相似的结果,花青素在碱法条件下对SPI进行共价交联后,其形成的复合物溶液液滴直径在0.05～0.4 μm的相对体积居多,但是AC1、AC2、AC3溶液的粒径分布没有太明显的差异。

图5 花青素-SPI共价复合物的粒径分布Fig.5 Particle size distribution of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

3 结论

采用生物酶法和化学碱法共价交联花青素与SPI,探究不同共价交联方式对SPI功能性质的影响。结果表明花青素对SPI的共价交联会降低SPI的表面疏水性,使SPI的表面呈现出更加亲水性的特性。而且,添加的花青素浓度越高,花青素-SPI的表面疏水性越低,尤其相较于SPI、LC3和AC3表面疏水性分别减少了87.71%和82.71%;花青素对SPI的共价交联可以改善SPI的起泡性,起泡稳定性,乳化性和乳化稳定性,生物酶法比化学碱法的改善效果明显;SPI中花青素的引入使ζ-电位的绝对值得以提高,溶液液滴粒径分布更加均匀,其溶液的稳定性更强。尤其LC3的ζ-电位绝对值比SPI和AC3分别高了64.35%和10.98%。以上结论为生物酶法和化学碱法交联花青素与SPI对蛋白功能产生的影响结果提供了部分参考,为花青素-蛋白共价复合食品的合理应用提供一定的理论依据。