组蛋白去乙酰化酶抑制剂对脑胶质瘤干细胞的作用及其机制▲

冀保卫 陈丽华 陈治标 蔡 强

(武汉大学人民医院1 神经外科，2 麻醉科，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：jbw2002@whu.edu.cn)

脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤，发病率高，约占成人原发颅内肿瘤的80%。目前临床上多采用以手术为主的综合方法治疗脑胶质瘤，但其预后仍较差，死亡率高[1-2]。近年来，肿瘤干细胞的发现为肿瘤的治疗带来曙光，目前已在多种肿瘤内发现干细胞的存在[3-5]。已有研究证实胶质瘤干细胞较普通胶质瘤细胞具有更强的耐药性，是肿瘤复发的主要原因，但目前尚无可靠方法有效杀伤体内胶质瘤干细胞[6-8]。因此，探索针对胶质瘤干细胞的靶向治疗方法意义重大。组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275是近年来发现的对多种肿瘤细胞具有较好治疗作用的新型抗肿瘤药物[9]，已被证实能显著抑制胶质瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡[10]。本研究探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对胶质瘤干细胞的作用及其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 胶质瘤母细胞标本来源于2017年1月至2017年12月武汉大学人民医院神经外科收治的22例脑胶质瘤患者术中切除的肿瘤组织。其中男性12例，女性10例，年龄(56±2)岁，纳入标本均经病理证实为胶质瘤母细胞，排除病理性质不明确的标本。获取标本前已获得患者及家属同意。本研究获得武汉大学人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12培养基(批号：11320-033)购自HyClone公司，特优级胎牛血清(fatal bovine serum，FBS；批号：12483-020)、B27添加剂(批号：17504044)均购自Invitrogen公司，碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF；批号：100-18B)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF；批号：100-47)均购自PeproTech公司，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF；批号：GF342)购自Millipore公司，MS-275(批号：S1053)购自Selleck公司，细胞计数(cell counting kit-8；CCK-8，批号：CK04)试剂盒购自Dojindo公司，藻红蛋白标记小鼠抗人CD133单抗(批号：130-111-079)购自Miltenyi公司，抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1单抗(批号：2922S)购自Cell Signaling公司，兔源多抗(批号：sc-358919)购自Santa Cruz公司，碘化丙啶(批号：ST512)、核糖核酸酶(批号：ST576)、细胞裂解液(批号：P0013)、免疫印迹试验凝胶电泳试剂盒(批号：P0012A)购自碧云天公司。

1.3 胶质瘤干细胞的分离培养及分组 参照文献[11]的方法分离、培养脑胶质瘤干细胞：将新鲜脑胶质母细胞瘤组织剪成大小约1 mm3的组织块，应用胰蛋白酶消化分解，无菌生理盐水清洗后获得胶质瘤母细胞；将细胞置于无血清DMEM/F12培养基(含LIF 10 ng/ml，EGF 20 ng/ml，bFGF 20 ng/ml，B27 20 μl/ml)中于37℃、5% CO2、95%湿度培养箱培养约1周，即可获得胶质瘤干细胞球；将细胞球吹散稀释后再培养传代，传代后仍在无血清DMEM/F12培养基于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养，收集第4代细胞进行后续实验。成功分离出胶质瘤干细胞后将其分为实验组与对照组。

1.4 检测方法

1.4.1 CCK-8法检测细胞增殖情况：将对数生长期胶质瘤干细胞吹打成单细胞悬液，使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)调整细胞浓度，使用细胞计数板计数单位体积悬液内细胞数，调整细胞终浓度为1×104个/ml，接种于96孔板中，200 μl/孔，实验组每孔加入10 nmol/ml MS-275，对照组每孔加入等体积PBS。将细胞置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱培养48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μl，37℃避光孵育1 h，用酶标仪检测实验组和对照组中各孔吸光度(A值)，依据如下公式计算增殖抑制率：抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。每组设置10复孔。增殖抑制率=0表示药物无作用，增殖抑制率<0表示药物可促进细胞增殖，增殖抑制率>0表示药物抑制细胞增殖。

1.4.2 单克隆法检测单克隆形成率：将对数生长期胶质瘤干细胞吹打成单细胞悬液，使用PBS调整细胞浓度，使用细胞计数板计数单位体积悬液内细胞数，调整细胞终浓度为0.5×103个/ml，接种于96孔板中，每孔200 μl，实验组每孔加入10 nmol/ml MS-275，对照组每孔加入等体积PBS。观察并计数只有1个细胞的孔，然后置于无血清DMEM/F12培养基中于37℃，5% CO2，95%湿度的培养箱培养1周后计数形成细胞球的孔数，与培养开始时单个细胞孔总数的比值，即为克隆形成率。重复测定5次，取平均值。克隆形成率下降代表具备干细胞特性的细胞比例下降。

1.4.3 流式细胞仪检测CD133+细胞含量：将对数生长期肿瘤干细胞均匀悬浮于含MS-275的无血清DMEM/F12培养基中，按照2×105个/孔的密度接种细胞于6孔板中，两组各3孔，实验组每孔加入10 nmol/ml MS-275，对照组每孔加入等体积PBS，置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱培养72 h，PBS洗涤3次，调整细胞浓度约1×106个细胞/100 μl，加入藻红蛋白标记的CD133试剂5 μl/100 μl，避光4℃孵育30 min，稀释至细胞浓度为约5×105个细胞/ml，采用贝克曼公司XL型流式细胞仪检测CD133+细胞含量。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期：将对数生长期胶质瘤干细胞按照2×105个/孔的密度接种细胞于6孔板中，实验组每孔加入10 nmol/ml MS-275，对照组每孔加入等体积PBS后于37℃、5% CO2、95%湿度下孵育48 h， PBS洗涤1次，加入碘化丙啶和核糖核酸酶，室温下避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期变化。细胞周期分为G0/G1、S、G2/M3期。

1.4.5 免疫印迹试验法检测Cyclin D1蛋白相对表达量：将对数生长期胶质瘤干细胞按照2×105个/孔的密度接种细胞于6孔板中，实验组每孔加入10 nmol/ml MS-275，对照组每孔加入等体积PBS后于37℃、5% CO2、95%湿度下孵育48 h，收集细胞，加入300 μl细胞裂解液，4℃下孵育30 min，收集裂解物，4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清，二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。按50 μg/孔上样，行常规变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室温下封闭2 h，一抗封闭4℃过夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入按1 ∶6 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，电化学发光液室温孵育约30 s，避光显影于X线胶片，实验重复3次。使用QuantityOne Basic软件计算免疫印迹蛋白条带灰度值，以肌动蛋白作为参照，获得两组相对灰度值，即为两组Cyclin D1蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组胶质瘤干细胞增殖能力的比较 实验组A值为(0.790±0.212)，低于对照组的(1.102±0.620)(t=2.402，P=0.042)，细胞增殖抑制率为(28.30±0.72)%。

2.2 两组脑胶质瘤干细胞单克隆形成率比较 实验组克隆形成率为(32.284±0.011)%，低于对照组的(87.261±0.002)%(t=4.592，P=0.009)。

2.3 两组脑胶质瘤干细胞CD133+细胞含量比较 实验组CD133+细胞含量为(29.485±1.106)%，低于对照组的(89.210±1.120)%(t=10.320，P=0.001)。

2.4 两组各细胞周期细胞比例比较 实验组G0/G1期细胞比例高于对照组，S期细胞比例低于对照组(均P<0.05)，两组G2/M期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组各细胞周期细胞比例比较(x±s，%)

2.5 两组脑胶质瘤干细胞Cyclin D1蛋白相对表达量比较 实验组Cyclin D1蛋白相对表达量为(0.426±0.325)，低于对照组的(0.561±0.234)(t=3.273，P=0.048)，见图1。

图1 两组脑胶质瘤干细胞的Cyclin D1蛋白表达情况

3 讨 论

近年来，脑胶质瘤干细胞的发现为脑胶质瘤的治疗提供了新的研究方向。脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤的起源细胞之一，如能有效抑制胶质瘤干细胞增殖或促进其死亡，则有望延迟脑胶质瘤的复发，甚至治愈脑胶质瘤。但目前针对脑胶质瘤干细胞进行治疗的效果尚不能令人满意[8]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂被广泛应用于各种肿瘤的治疗研究，其对脑胶质瘤细胞也有一定的治疗效果[10]，但对脑胶质瘤干细胞是否具有杀伤作用，目前的研究证据尚不充分，还需要进一步研究。

本研究旨在分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275干预后脑胶质瘤干细胞的生物学变化。根据本课题组预实验研究结果，将MS-275终浓度定位为10 nmol/ml[12]。结果显示，实验组细胞增殖抑制率近30%，提示经MS-275干预后，脑胶质瘤干细胞增殖能力明显降低，生长缓慢，这与MS-275对胶质瘤细胞的作用类似[12]。单克隆性与CD133表达阳性是脑胶质瘤干细胞的主要生物学特性，也是区别于普通胶质瘤细胞的特征，常被用来作为鉴定脑胶质瘤干细胞的指标[13]。本研究结果显示，实验组克隆形成率及CD133+细胞含量均低于对照组(均P<0.05)，说明经MS-275干预后，脑胶质瘤干细胞单克隆形成能力下降，细胞不再具有无限增殖能力，体内成瘤的潜在能力下降，并趋向分化。

为探讨MS-275抑制脑胶质瘤干细胞增殖的机制，我们对脑胶质瘤干细胞的细胞周期进行检测。结果显示，实验组G0/G1期细胞比例高于对照组(P<0.05)，表明经MS-275干预后，脑胶质瘤干细胞增殖被阻滞于G0/G1期。调节细胞周期的蛋白较多，其中Cyclin D1蛋白主要参与细胞周期G1调控，其主要功能是促进细胞增殖，推动细胞周期由G1时期进入到S时期[14]。研究表明，Cyclin D1是一种原癌基因，其过度表达可导致细胞增殖失控而发生恶变[15]，也可结合组蛋白去乙酰化酶，促进其基因转录[16]。本研究中，经MS-275干预后脑胶质瘤干细胞Cyclin D1蛋白表达下降，这可能是导致MS-275干预后脑胶质瘤干细胞的细胞周期停滞于G1期的原因。因此，MS-275抑制脑胶质瘤干细胞增殖的原因可能为：(1)通过下调Cyclin D1蛋白的表达水平，使脑胶质瘤干细胞不能从G1期进入到S期；(2) 抑制脑胶质瘤干细胞内组蛋白去乙酰化酶的部分活性，阻止Cyclin D1与组蛋白去乙酰化酶的结合，从而抑制基因转录。

研究表明，组蛋白去乙酰化抑制剂能从多条途径发挥抗肿瘤作用，如MS-275能使脑胶质瘤细胞侵袭性下降、迁移受阻；通过抑制信号传导及转录激活因子3磷酸化诱导胶质瘤细胞发生凋亡；还可通过抑制IκB-α的磷酸化水平进而抑制核转录因子-κB的活性、诱导骨髓瘤细胞U266发生凋亡等[17-20]。MS-275对脑胶质瘤干细胞增殖的抑制作用是否与上述机制有关，还需要进一步研究证实。

综上所述，组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275能抑制脑胶质瘤干细胞增殖，并促进其分化，其机制可能与MS-275降低脑胶质瘤干细胞Cyclin D1蛋白表达而导致细胞周期受阻滞有关。