半夏泻心汤对衰老大鼠学习记忆能力的改善及分子机制*

彭 旭 张晓梅 何学令 刘 艳

(四川大学实验动物中心，成都 610041)

人在自然衰老过程中，随着年龄的增长会出现记忆力减退、反应迟钝、认知功能下降等脑功能障碍症状。学习记忆是大脑的重要功能之一，而学习记忆的作用机制与中枢胆碱能神经系统、单胺类神经递质NE、DA、5-HT密切相关，它们之间相互制约且处于一种平衡状态[1]。半夏泻心汤(BXT)源自张仲景《伤寒杂病论》，本方攻补兼施、升降并用，其辛开、苦降、甘补的组方配伍，一直以来是基础研究及临床应用的热点复方之一[2]。在我们的前期研究中发现，BXT及其拆方可通过影响脾虚大鼠下丘脑中NE、DA、5-HT神经递质的水平，调节大鼠的脾胃功能[3]。渡边雄泰[4]等研究表明BXT对应激性溃疡不仅直接作用于消化系统，而且通过介导脑内情感系统的中枢抑制作用而发挥治疗效果。张忠等[5]研究BXT及其拆方对应激性胃溃疡大鼠胆碱能神经元的影响，结果显示BXT全方组及各拆方组除作用于胃黏膜本身引起胃黏膜本身分泌改变之外，还影响到脑的分泌功能。上述研究表明，BXT的作用机制与脑内的神经递质有一定的关系。此外，根据中医理论，BXT是辛开苦降的代表方剂，对梳理脾胃气机之升降，调节全身气机之运行，非常合乎老年人精气不足的体质特点，因此推测BXT对于抗衰老有一定的作用。本研究旨在分子水平上研究半夏泻心汤对衰老大鼠大脑海马区Ach、NE、DA、5-HT受体mRNA表达的影响，对其可能的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠120只，SPF级，雌性，体质量(400±20)g，15月龄。另取10只SD大鼠，SPF级，雌性，体质量(200±100)g，6月龄，作为壮年对照组。实验动物均由四川省中医药科学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(川)2013-19；动物实验在四川大学实验动物中心完成，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2015-185。

1.2 药品与试剂

根据《伤寒论》BXT全方组成为半夏12 g，干姜9 g，黄芩9 g，黄连3 g，人参9 g，炙甘草9 g，大枣4枚。以上中药饮片均购于四川省中药饮片有限责任公司，大枣自配。用蒸馏水常规煎煮2次，加热浓缩成每1 mL提取液中含1 g生药，置4 ℃冰箱储存备用。石杉碱甲片(河南太龙药业股份有限公司，批号:130904)使用前用0.5%羧甲基纤维素钠配成0.3%的溶液备用。D-半乳糖(上海金穗生物科技有限公司)；Trizol(Ambion公司)、逆转录试剂盒(Thermo)；CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因引物(成都宝信生物有限公司)；一抗，二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒[基因科技(上海)有限公司]。

1.3 仪器设备

MultiGene Optimax PCR仪(Labnet)；JY600C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；超纯水系统(Milipore)；显微镜及图像采集系统(Olympus)；切片机(Leica)；Autostainer 480 s全自动免疫组化仪(Thermo)；Y型水迷宫(自制)。

1.4 实验方法

1.4.1大鼠衰老模型建立：将120只15月龄大鼠进行Y型水迷宫测试，记录大鼠平均逃避潜伏期(从入水起点至寻找到阶梯出水的时间)和正确反应次数(以10 s内直接抵达平台为正确反应)[6]，每次测定时间为2 min，2min后仍未找到安全通道者以120 s计算。每只大鼠每天训练2次，共训练2 d。获得性训练结束后，正式进行测试，每只鼠每天测试1次，共3 d。

根据大鼠的逃避潜伏时间由高到低，筛选出学习记忆能力明显较弱的动物50只，随后在大鼠颈部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg体质量[7]，每天1次，连续给药4周。4周后再次进行Y型水迷宫测试，未通过测试大鼠，即为老龄模型大鼠。

1.4.2实验动物分组及给药：将老龄模型大鼠随机平均分为5组，根据治疗药物类型和剂量，分别为老龄对照组(生理盐水)、石杉碱甲组(作为药物治疗的阳性对照组)、BXT高剂量组、BXT中剂量组、BXT小剂量组。另选10只6月龄正常大鼠作为壮年对照组。

BXT组大鼠根据不同BXT剂量进行灌胃给药，BXT高剂量组10 mL/kg、中剂量组5 mL/kg、低剂量组2.5 mL/kg，石杉碱甲组30 mg/kg体质量，壮年对照组和老龄对照组灌胃生理盐水10 mL/kg。大鼠每周测体质量一次，按体质量调整给药剂量，连续给药6周。

1.4.3病理学及免疫组化检测：行为学检测结束后，各组大鼠放入4%异氟烷的诱导盒中进行诱导麻醉。大鼠进入麻醉状态后迅速取出，并行眼眶放血处死，打开头盖骨，迅速取出脑组织，于冰上剥离左侧大脑皮层和海马，置于4%多聚甲醛中固定。将脑组织块冠状位连续切片，片厚5 μm。每隔5张取1张，每例动物相邻切片分为3套，每套各5张，选取其中一套进行常规HE染色，树脂封片，进行组织病理学检测。另一套采用Envision二步法进行免疫组织化学染色。

1.5 Real-time PCR 检测Ach、NE、DA、5-TH受体mRNA表达

根据GenBank的序列，用Goldkey软件分别设计CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因的引物。根据RNA提取试剂盒说明书提取RNA，然后根据Thermo的逆转录试剂盒合成cDNA，最后进行PCR扩增。引物序列如下：

CHRM1上游引物5’-ATACAGTCAAGAGGC CCACC-3’；

下游引物5’-AGGAACACAGTCCTTGCAGA-3’，产物长度218 bp；

DRD2 上游引物5’-AAACCCGGACCTCC CTTAAG-3’；

下游引物5’-AGAGGACTGGTGGGATGTTG-3’，产物长度113 bp；

HTR1a 上游引物5’-ACCTCTCTGTTGCTG GGTAC-3’；

下游引物5’-CGATAAACAGGTCGCAGGTG-3’，产物长度719 bp；

ADRA2a上游引物5’-TTGGCCTTGTCGCGAT ATTG-3’；

下游引物5’-CCAGGGGACAGTTACCAGTT-3’，产物长度75 bp；

1.6 图像分析及数据处理

使用Olympus显微镜及图像采集系统对海马区Ach、NE、DA、5-TH受体阳性细胞进行采图。应用凝胶成像分析软件Gel-Pro-analyzer4.0分析受体和内参β-Actin的灰度值，并用GraphPad Prism软件做柱状图进行比较。

2 结果

2.1 Y型水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力

造模后，老龄对照组大鼠在Y型水迷宫中的逃避潜伏期较壮年对照组明显延长；与老龄对照组比较，在训练后24 h、48 h和96 h，各剂量BXT给药组均能明显缩短衰老大鼠逃避潜伏期，结果见图1。

2.2 海马区病理形态学观察

对各组大鼠海马区组织进行HE染色，结果如图2所示。壮年对照组海马组织各区显示清晰，神经元细胞丰富，数量较多，排列整齐，细胞形态正常，核大而圆，核仁明显，可见少量小胶质细胞，神经纤维清晰；老龄对照组可见海马各区神经元细胞不同

图1 BXT对大鼠逃避潜伏期的影响Fig.1 Effect of BXT on escape latency of rats

程度减少，出现神经元萎缩(红色神经元)，小胶质细胞增生、血管套以及噬神经现象；BXT高剂量组和石杉碱甲组海马神经元损伤均有所改善，改善程度基本相同，但BXT中剂量组和低剂量组同老龄对照组相比未见明显改善。

图2 海马区HE染色观察(×200)注：a：老龄对照组；b：石杉碱甲组；c：壮年对照组；d：BXT低剂量组；e：BXT中剂量组；f：BXT高剂量组Fig.2 HE staining of hippocampus(×200)Note:a:aging control group;b:huperzine A group;c:strong control group; d:BXT low dose group,e:BXT medium dose group;f:BXT high dose group

2.3 免疫组织化学染色结果

对大鼠海马区组织进行免疫组化染色，各组大鼠海马区DRD2、CHRM1、HTR1α、ADRA2α的表达和分布情况如图3～6所示。椎体细胞的细胞膜和细胞质内出现了深棕色的阳性细胞染色反应，而椎体细胞周围未见其他细胞有着色。从形态结构看，壮年对照组海马区椎体细胞染色数量多且颜色深，排列紧密整齐，层次结构明显；老龄对照组海马区椎体细胞染色数量少且颜色很浅，排列疏松，细胞间隙较大，层次结构不明显；BXT高剂量组和石杉碱甲组椎体细胞染色数量和颜色以及排列紧密度介于壮年对照组和老龄对照组之间，对受体的表达有明显的增强作用，结构层次也有改善，这说明高剂量BXT对海马区的损伤有一定的保护作用，保护程度与石杉碱甲组类似，但中剂量组和低剂量组椎体细胞的阳性反应程度与老龄对照组相比未见明显差异。

2.4 BXT对大鼠海马区CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表达的影响

mRNA表达结果显示，BXT低剂量组和中剂量组的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA相对表达量均低于大剂量组，而HTR1α mRNA相对表达量在BXT各组中表达量差异不明显；壮年对照组的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA相对表达量均高于其余五组，而老龄对照组偏低，尤其在CHRM1和HTR1α mRNA表达量上显著低于其它组。见图7和图8。

图3 海马区DRA2表达情况(深棕色，×200)注：a：老龄对照组；b：石杉碱甲组；c：壮年对照组；d：BXT低剂量组；e：BXT中剂量组；f：BXT高剂量组Fig.3 Expression of DRA2 in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group;d:BXT low dose group; e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

图4 海马区CHRM1表达情况(×200)注：a：老龄对照组；b：石杉碱甲组；c：壮年对照组；d：BXT低剂量组；e：BXT中剂量组；f：BXT高剂量组Fig.4 Expression of CHRM1 in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

图5 海马区ADRA2α表达情况(×200)注：a：老龄对照组；b：石杉碱甲组；c：壮年对照组；d：BXT低剂量组；e：BXT中剂量组；f：BXT高剂量组Fig.5 Expression of ADRA2α in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

图6 海马区HTR1α表达情况(×200)注：a：老龄对照组；b：石杉碱甲组；c：壮年对照组；d：BXT低剂量组；e：BXT中剂量组；f：BXT高剂量组Fig.6 Expression of HTR1α in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

图7 海马区DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA表达的影响注：a：BXT低剂量组；b：BXT中剂量组；c：BXT高剂量组； d：石杉碱甲组；e：壮年对照组；f：老龄对照组Fig.7 Expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampusNote: a:BXT low dose group; b:BXT medium dose group; c:BXT high dose group;d: Huperzine A group; e: Strong control group;f: Aging control group

图8 海马区DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA相对表达量Fig.8 Relative expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampus

3 讨论

哺乳动物随着年龄的增加，海马区的形态结构、功能以及一些相关蛋白质分子发生改变，被认为是海马功能衰退的基础。在本次实验中通过大鼠行为学试验，我们发现经高剂量BXT治疗过的老年大鼠能够明显缩短逃避潜伏期，与老龄对照组相比，差异极显著(P<0.01)。HE染色和免疫组化染色结果都显示，BXT大剂量组的海马区受损的神经元也有所改善。这提示BXT对老年鼠的海马区受损部位有一定程度的改善作用。

NE在记忆保持方面起重要作用，而改善记忆与促进DA的释放有关，5-HT则与精神活动、感觉体温调节、高级认知功能有关。当机体逐渐衰老后，脑内单胺类神经递质亦发生代谢紊乱，表现为NE、DA和5-HT含量下降，其含量下降是造成学习记忆能力减退的重要原因[6，8]。陈乔等用放射自显影方法研究表明，老年大鼠大脑皮质及海马部位CHRM1密度显著低于壮年对照鼠，并提出这3个脑区 CHRM1受体密度的降低可能是衰老时学习、记忆、联想、认知等功能障碍的重要机制之一[9]。Wilkerson and Levin[10]研究发现，腹侧海马注入DRD2激动剂可提高大鼠工作记忆的能力，相反注入DRD2受体拮抗剂则降低工作记忆的能力，故提示了DRD2参与记忆功能。梁发权和吕宝璋[11]采用放射性配基结合分析法发现老年大鼠(36月龄)大脑皮质中5-HT受体的数目较成年大鼠(3月龄)明显减少，提示老年鼠中枢5-HT系统的功能降低，可能与老年期的一些表现如记忆力衰退、睡眠障碍有关。本实验观察到，模型组的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表达明显弱于壮年组，甚至出现一些无表达现象，这与其他学者的研究结果是一致的，衰老时会出现中枢学习、记忆力以及认知等功能的下降，这与大脑海马区Ach、NE、DA、5-TH受体mRNA表达下降的现象有密切关系。

石杉碱甲是一种强效的可逆性胆碱酯酶抑制剂，并可增强大鼠海马CA1锥体神经元的兴奋性突触传递，其增强突触传递作用与M型乙酰胆碱受体激动有关[12]。BXT高剂量组与石杉碱甲组的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA表达趋于一致性，这说明高剂量BXT对海马区的损伤有一定的保护作用，保护程度与石杉碱甲组类似。另外，有研究报告表明胆碱酯酶抑制剂通过M1型胆碱能受体能够使行为大鼠CA1区的长时程增强[13-14]。在我们之前的研究中发现，半夏泻心汤给药组可明显上调脑组织胆碱能受体M1的表达[15-16]，故我们推测BXT抗衰老的作用机制与CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α基因表达有关，BXT可以激活其mRNA的表达，从而对衰老大鼠脑组织中Ach、NE、DA、5-TH起到一定的调节作用。由于中药的作用是多靶点、多效应作用的结果，因此在接下来的工作中还要再进一步对BXT参与机体抗衰老的作用机制进行研究。