六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸 提取效率的比较*

桂 飞 杨伟伟 俞利平 戴方伟 杜江涛 宋晓明

(1. 杭州师范大学实验动物中心, 杭州 310036)(2. 浙江省医学科学院实验动物中心, 杭州 310013)

小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)属于冠状病毒科、冠状病毒属，基因组为线性不分段的单股正链RNA[1]。MHV感染是一种严重危害小鼠生产的病毒性传染病，不仅严重影响实验动物的质量，还对科学研究结果造成潜在的干扰，影响实验的准确性和重复性。正常情况下呈隐性感染，应激激发时会诱发致死性病变，是一种广泛传播且顽固的病原，也是国标GB 14922.2《实验动物微生物等级及检测》[2]中所需排除的病原之一。近年来，随着遗传工程小鼠制备技术的迅速发展，携带MHV的遗传工程小鼠在不同实验动物设施间被广泛交流和传播，且难于被发现和有效控制，MHV已是遗传工程小鼠微生物控制中最难于生物净化的病原之一[3]，因此，快速准确地检测MHV是有效防制该病的前提，加强对MHV诊断的研究对提高实验动物质量具有重要意义。

MHV的诊断方法有病毒分离与鉴定、血清学试验、组织病理学诊断和分子生物学诊断等，实时荧光定量PCR检测技术[4-5]即为其中一种。该技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，但影响其检测效果的因素有很多，除引物序列、反应体系、扩增条件等，病毒RNA的提取效率也十分关键。本研究针对市售的6种病毒RNA提取试剂盒开展提取效率、操作简便性及重复性等比较，探索更有效的粪便病毒核酸提取方法，为提高MHV的分子生物学检测准确性提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物: 14只6～8周龄C57BL/6小鼠，由杭州师范大学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(浙)2016-0004，经PCR鉴定为MHV阳性。小鼠饲养在隔离器中，每笼饲养1只，使用许可证：SYXK(浙)2016-0006，自由采食和饮水。

1.1.2试剂: TIANamp RNA Kit for Virus Detection(TIANGEN SD101)、DNA/RNA Isolation Kit(TIANGEN DP422)核酸提取试剂盒以及Fast Quant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN KR106)反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN 52904)购自QIAGEN公司；Power Microbiomewer MicrobioNA Mini(MO BIO 26000)购自深圳安必胜生物技术有限公司；MagMAX必胜生物技术有限公司；Mini Kit Detection 酸提取方法(ABI AM1840)以及TaqMan© Gene Expression Master Mix(ABI 4369016)购自ABI公司；小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒(XS VRL)购自苏州西山生物技术有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-01)胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.1.3主要仪器与设备: 水平电泳仪(Tanon)、微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 2000)、凝胶成像处理系统Gel Image System(Tanon)、普通PCR扩增仪(Bio-RAD)、实时荧光PCR仪(ABI One step plus)、生物安全柜(Thermo)、全自动样品快速研磨仪(上海净信实验发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物与探针的设计: 从NCBI的FTP中下载两株MHV基因组序列，分析比对结果，发现基因28879-29145 Murine hepatitis virus strain JHM，29142-29828 Murine hepatitis virus strain JHM, 29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM有非常好的种内特异和种间的差异性。选择了此3个基因作为候选基因，用Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量PCR引物对和探针，经过筛选和验证，本研究最终选取29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM作为靶基因。引物、探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成(见表1)。

表1 MHV TaqMan荧光定量PCR引物及探针序列Table 1 MHV TaqMan fluorescent quantitative PCR primers and probe sequences

1.2.2样品的收集及前处理:连续无菌采集小鼠新鲜粪便，充分混匀，分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法3种前处理方法处理，重复提取3次。液氮研磨法：取新鲜粪便在液氮环境下充分研磨，20 mg/份分装，分装3份，加入600 μL裂解液，涡旋混匀后，按试剂盒操作步骤提取。磁珠均浆法：取新鲜粪便20 mg/份分装，分装3份，分别于磁珠混合后加入600 μL裂解液，使用磁珠匀浆仪55 Hz，10 min充分研磨后，按试剂盒操作步骤提取。PBS溶解离心法：取新鲜粪便20 mg/份分装，分装3份，分别溶于140 μL无菌PBS缓冲液，涡旋混匀后12 000 r/min离心5 min后，取上清液于另一RNase-Free的离心管中，加入600 μL裂解液，充分混匀后，按试剂盒操作步骤提取。

同时采集血清样本，用于检测抗体情况。另取小鼠粪便，在液氮环境下充分研磨， 20 mg称量分装，用于固体组试剂盒提取；取20 mg粪便溶于140 μL RNase-Free的PBS缓冲液中，充分混匀后，用于液体组试剂盒提取。

1.2.3核酸提取: 根据6种不同试剂盒所针对提取样本的差异，可将试剂盒分为固体样本提取组和液体样本提取组，TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL 3个试剂盒为固体样本提取组，TIANGEN SD101、QIAGEN 52904、ABI AM1840 3个试剂盒为液体样本提取组。按照试剂盒说明书，手动提取病毒RNA，并进行核酸浓度测定，常规方法反转录成cDNA，-20 ℃保存备用，重复提取3次。

1.2.4实时荧光定量TaqMan-PCR检测：用TaqMan试剂盒对不同方法提取的病毒RNA进行检测，反应体系如下：2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，探针(5 μmol/L)1 μL，模板cDNA 2.0 μL，补水至 25 μL。扩增程序为： 50 ℃培育 2 min，95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 1 min，共 40 个循环，收集荧光信号并读取数据。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 样本前处理方法比较

分别用磁珠匀浆法、液氮研磨法以及PBS溶解离心法，对3份MHV阳性小鼠的粪便进行处理，使用TIANGEN DP422核酸提取试剂盒提取病毒RNA，通过实时荧光定量TaqMan-PCR进行检测，结果显示，液氮研磨法对病毒RNA提取效率显著高于另外两种，见表2。同时，实时荧光定量TaqMan-PCR 检测结果显示，针对小鼠肝炎病毒，液氮研磨法提取效率也是最高的，见表3。

表2 3种样本前处理方法比较的结果Table 2 Results of comparison of three sample pretreatment methods

注：**表示差异极显著，P<0.01

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01

表3 TaqMan荧光定量PCR对比结果Table 3 Comparison results of TaqMan fluorescence quantitative PCR

注：**表示差异极显著，P<0.01，Undetermined表示未检出

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01，Undetermined means not detected

2.2 6种试剂盒提取MHV核酸效率的比较

利用6种试剂盒，分别提取MHV阳性小鼠的粪便样本，通过实时荧光定量TaqMan-PCR进行检测。结果显示，在提取效率上，TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL、QIAGEN 52094、TIANGEN SD101均具有较高的提取效率，其中 TIANGEN DP422核酸提取效率最高，且显著高于其他各试剂盒(见表4)。荧光定量TaqMan-PCR 检测，TIANGEN DP422、XS VRL、QIAGEN 52094、TIANGEN SD101以及ABI AM1836 5种试剂盒均能得到特异性的扩增条带和曲线(见图1)，MO BIO 26000试剂盒未检出MHV，TIANGEN DP422和XS VRL试剂盒的Ct值较低，针对小鼠肝炎病毒提取效果较好，其余3种试剂盒无显著差异。产物测序结果与NCBI的FTP中下载2株MHV基因组序列比对一致。同步开展的重复性试验表明，QIAGEN 52904试剂盒(变异系数：0.02991)重复性最好，TIANGEN DP422试剂盒(变异系数：0.03212)次之，详见表5。

表4 6种试剂盒对粪便中病毒RNA提取效率比较结果Table 4 Comparison of the efficiency of viral RNA extraction from feces in six kits

注：**表示差异极显著，P<0.01

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01

表5 6种试剂盒TaqMan-qPCR检测结果Table 5 Results of six kits TaqMan-qPCR detection

图1 六种试剂盒检测的扩增曲线Fig.1 Amplification curves detected by six kits

3 讨论

针对小鼠肝炎病毒目前诊断的方法有病毒分离与鉴定、血清学试验、组织病理学诊断、分子生物学诊断等。实时荧光定量PCR检测技术即为其中一种。本实验从粪便中提取小鼠肝炎病毒RNA检测，遵循实验动物“3R”原则的同时，尽可能减少病原检测对本动物的应激刺激或牺牲。但粪便样本复杂，病毒RNA极易被降解，很大程度上影响了MHV核酸的提取效率，因此粪便样本的前处理尤为重要。本实验选用液氮研磨法、磁珠匀浆法和PBS溶解离心法进行比较，液氮研磨法需手动研磨且需近距离的接触液氮，耗时费力，具有一定的危险性；磁珠匀浆法使用磁珠匀浆仪自动匀浆处理，操作较为简便；PBS溶解离心法操作最简便。考虑到提取效率的优势，选用液氮研磨法。与李冬民等[6]、戴方伟等[7]描述基本一致，可用于荧光定量PCR检测研究中。但针对大量样本的检测，建议可使用磁珠匀浆法提取。刘香梅等[8]在自然感染小鼠肝炎病毒的早期检测过程中，也从小鼠粪便中检测到MHV，提示PCR法在早期诊断中的优势。

据相关研究表明, 不同试剂盒的病毒核酸提取效率具有一定差异[9-11]。因此，选择提取效率高、价格低、操作方便的试剂盒，以便快速有效地进行病原检测十分重要。本研究选用了市售的6种核酸试剂盒进行比较，6种试剂盒均为手动提取，按试剂盒说明书进行操作，耗时按单个样本提取计。在提取效率上，固体样本组3种方法(TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL)均具有较高的提取效率，TIANGEN DP422提取效率最高，且与其他几个试剂盒具有显著差异。在重复性方面，6种试剂盒均较好。从各试剂盒的提取方法、价格、提取时间、提取样本量以及所需自备试剂和辅助设备等因素综合分析，ABI AM1836为磁珠法提取，需要辅助磁力架提取，提取样本量受限于所选磁力架的规格，本实验室选用磁力架可同时提取8个样本，提取的样本量较小，不适宜大量样本提取。其余五种均为膜吸附法提取，其中MO BIO 26000试剂盒使用时，需额外附加涡旋仪适配器，以辅助提取过程，单次可提取样本量最大，但操作步骤比较繁琐，耗时较长，价格较贵(100元/份样本)，且针对小鼠肝炎病毒未能检出。QIAGEN 52094和TIANGEN SD101主要针对液体样本，针对固体粪便样本操作则较TIANGEN DP422和XS VRL繁琐，且相比提取效率也具有显著差异，可能提取小鼠尿液更具优势。TIANGEN DP422试剂盒价格较便宜(28元/份样本)。

综合以上因素分析认为，粪便样本的前处理，液氮研磨法较好；粪便中小鼠肝炎病毒RNA的提取，TIANGEN DP422效率最高，价格较便宜，推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。