不同功率532 nm激光诱导棕色挪威大鼠脉络膜 新生血管模型的实验研究*

孟 梁 梁凤鸣 王 莉 黎红梅 张欣桐

(1. 天津市滨海新区中医医院，天津 300340)(2. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300391)

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是视网膜-脉络膜毛细血管复合体，其生成与(或)破裂是导致眼底渗出、出血的关键，也就是直接导致患者视力下降、视物变形、视野缺损的直接原因。因此各种造成脉络膜新生血管生成与破裂的相关疾病，如湿性黄斑变性，中心性渗出性脉络膜视网膜病变，高度近视性视网膜病变等，已成为人群致盲的主要原因之一[1]。现阶段国内外对于激光诱导棕色挪威大鼠(Brown Norway，BN)产生CNV的机理已达成共识。唐坤用532 nm激光，功率160～170 mW,光斑直径50 μm，曝光时间0.1 s，围绕视盘约2～3个PD光凝BN大鼠，每眼6～8个点，证实532激光诱导BN大鼠CNV动物模型，且CNV模型于21 d达到成熟[2]。 张舒阳等通过532 nm激光对BN大鼠造模，在曝光时间0.1 s，光斑直径100 μm条件下，功率分别选择100 mW、200 mW、300 mW，证实激光功率在300 mW时CNV成模率最高；CNV形成面积、中央厚度最大，是激光诱导BN大鼠CNV模型较为理想的激光功率[3]。任秉仪等通过532 nm激光对40只BN大鼠进行试验，每两个血管弓之间光凝1～2个激光斑，证实大鼠造模后1个激光斑比2个激光斑的成模率高[4]。通过532 nm激光造模的实验研究，存在不同功率的选择，我们拟通过实验探讨不同功率激光诱导BN脉络膜新生血管模型的成功率,旨在选择合适的激光功率以提高BN大鼠的成模率。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性棕色挪威大鼠(BN) 45只,9～11周龄,体质量200～250 g,由北京维通利华实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，使用许可证号：SYXK(津)2014-0002。

1.2 实验仪器及药品

盐酸丙美卡因滴眼液 (商品名爱尔凯因,S.A.ALCON-COUVREUR N.V.比利时)用以表面麻醉,复方托吡卡胺滴眼液 (沈阳兴齐眼药股份有限公司)以散瞳；1%戊巴比妥钠(上海泰瑞尔生物技术有限公司)以腹腔麻醉；10%荧光素钠注射液 (广西梧州制药股份有限公司)用于眼底荧光血管造影检查；眼底彩照造影机(日本kowa)用于拍摄眼底彩照和荧光素眼底血管造影术(fluorescein fundus angiography,FFA) 检查；光学相干断层扫描仪(Optical coherence tomography，OCT)(海德堡)以观察视网膜结构；532 nm绿光激光机 (法国光太)用以不同功率激光进行造模。

1.3 CNV造模及检查方法

动物实验通过了单位伦理委员会或管理委员会审批后，对45只BN大鼠行双眼检查，前节和眼底检查均未见明显异常，在实验室喂养1周，后随机将其分为3组，每组15只，激光功率依次为400 mW、300 m W、200 m W。进行造模前，BN大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(4 mL/kg体质量)进行麻醉，均选择左眼表面麻醉和散瞳后，用不同功率的激光，光斑直径100 μm，曝光时间100 ms，每眼光凝10～12个点，光凝后视网膜以有气泡产生或轻度出血为准。

各实验组大鼠激光造模后的第1周、2周、3周、4周行眼底彩照、荧光素血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA) 和光学相干断层扫描(Optical Coherence Tomography，OCT)。FFA显示光斑渗漏则表示造模成功，并对激光斑渗漏部位进行分级，标准如下[2]：Ⅰ级，注射荧光素500～600 s后，眼底未见荧光素渗漏；Ⅱ级，注射荧光素500～600 s后，眼底存在轻度荧光素渗漏；Ⅲ级，注射荧光素500～600 s后，眼底存在中度荧光素渗漏；Ⅳ级，注射荧光素500～600 s后，眼底可见大量荧光素渗漏。

1.4 统计方法

采用SPSS19软件，对实验数据进行分析，单向有序资料用秩和检验，构成比用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BN大鼠存活情况

本实验采用3个不同功率的532 nm激光分别对15只BN进行造模研究，从实验为期4周时间的存活率来看，200 mW和300 mW实验组的BN大鼠均有不同程度的死亡，但是总的存活率维持着80%，而400 mW的实验组只有46.67%的存活率，考虑与激光功率太大造成大鼠死亡率上升有关。

表1 不同功率激光同一时间BN大鼠的存活数量的组间比较Table 1 Comparison of the survival numbers of BN rats at different power lasers at the same time

2.2 眼底彩照结果

通过532 nm激光破坏了正常的视网膜结构，导致视网膜缺血缺氧，诱发激光斑周围视网膜水肿，呈灰白色，实验结果如图1。

图1 不同级别的荧光渗漏图注:Ⅰ级:眼底未见荧光素渗漏；Ⅱ级:眼底存在轻度荧光素渗漏;Ⅲ级:眼底存在中度荧光素渗漏;Ⅳ级:眼底可见大量荧光素渗漏Fig.1 Different levels of fluorescence leakageNote:Ⅰdegree:non-fluorescein leakage;Ⅱ degree:a little fluorescein leakage;Ⅲ degree:moderate fluorescein leakage; Ⅳ degree:lager amount of fluorescein leakage

2.3 FFA检查结果

FFA检查前，对BN大鼠进行腹腔及表面麻醉、散瞳，步骤同激光造模，后予以腹腔注射10%的荧光素钠(0.5 mL/kg)，用眼底彩照造影机进行检查。

2.3.1同一时间段的不同功率激光光凝渗漏率的组间比较，结果如下：

同一时间段的不同功率激光光凝渗漏率的组间比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。从实验数据分析来看同一时间段功率200 mW的与300 mW和400 mW渗漏率比较均有统计学意义(P<0.05)，说明200 mW的激光能量相对较小，导致的荧光渗漏率都较低，成模率相对较低，而300 mW和400 mW相对比200 mW导致荧光渗漏率较高，成模率较高；功率为300 mW和400 mW在第1、3周时，其渗漏率差异无统计学意义(P>0.05)，说明第1、3周时，两组的成模率无差异，第2、4周对比渗漏率有统计学意义(P<0.05)，第2、4周时两组的成模率有差异。而且从光斑数量可以看出400 mW的功率造模后，光斑大面积融合，甚至导致BN大鼠眼底出血或者后期死亡，所以实验数据中有效数据随着时间的变化在不断减少，可能与400 mW的激光能量太大有关，所以功率为300 mW的激光造模是最佳选择。

表2 同一时间段的不同功率激光光凝渗漏率的组间比较Table 2 Comparison between groups of different power laser about fluorescein leakage at the same time period

注：资料为单向有序资料，同一功率组内总体比较用Kruskal-Wallis H检验；组内两两比较用秩和检验。同一时间的不同激光功率光凝渗漏率的比较：200和300 mW、200和400 mW比较，aP<0.05；300和400 mW比较,bP<0.05

Note: The data is one-way ordered data. The overall comparison between the same power group is performed by Kruskal-Wallis H test; the two groups are compared by signed-rank test.Comparison between groups of different power laser about fluorescein leakage at the same time period:200/300 mW、200/400 mW，aP<0.05；300/400 mW,bP<0.05

2.3.2同一功率的激光在不同时间段光凝渗漏率比较，如下：

同一功率的激光在不同时间段光凝渗漏率的组内比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。根据实验数据统计，200 mW的激光功率，第1周和第3周、第1周和第4周、第2周和第3周、第2周和第4周比较，其造模的渗漏率差异有统计学意义(P<0.05)，而第1周和第2周、第3周和第4周，其造模的渗漏率差异无统计学意义(P>0.05)，可能为第1、2周因为功率太小，造成的眼底渗漏率变化不大，于第3周开始增加，逐渐到高峰，第4周维持在稳定状态；功率为300 mW和400 mW的激光功率进行造模，除第3周和第4周对比，其造模的渗漏率差异无统计学意义(P>0.05)，其余时间两两对比，其造模的渗漏率差异有统计学意义(P<0.05)，说明随着时间的推移，其眼底渗漏率在逐渐增加，第3周到达高峰并于第4周维持稳定，证实532 nm激光诱导眼底CNV的形成在第3周达到高峰，并在第4周维持稳定状态。

表3 同一功率的激光在不同时间段光凝渗漏率的组内比较Table 3 Comparison of fluorescein leakage rates of the same power laser at different time periods

注：资料为单向有序资料，同行×列的卡方检验。同一功率不同时间段荧光渗漏率的比较.第1周和第2、3、4周比较，aP<0.05；第2周和第3、4周比较,bP<0.05

Note: The data is one-way ordered data, the two groups are compared by chi-square test.Comparison of fluorescein leakage rates of the same power laser at different time periods:1/2、1/3、1/4，aP<0.05；2/3、2/4,bP<0.05

2.4 OCT检查结果

OCT显示：200 mW的激光光凝后第1、2周OCT检查见光凝区视网膜神经上皮层开始断裂,呈现“凹”字改变；光凝后第3周见光凝区神经上皮层结构层次不清，呈白色高反射,从脉络膜突破RPE层进入神经上皮层，提示CNV已形成；光凝后第4周光凝区神经上皮层呈多层高反射信号，CNV呈进展期。300 mW的激光光凝后第1周OCT检查见光凝区视网膜神经上皮层断裂,呈现“凹”字改变；光凝后第2周见光凝区神经上皮层较前增厚，结构层次不清，呈白色高反射,从脉络膜突破RPE层进入神经上皮层，提示CNV已形成；光凝后第3周光凝区神经上皮层明显增厚，呈多层高反射信号，CNV达到高峰；光凝后第4周OCT显示视网膜结构与第3周相比无明显变化，CNV达到稳定期。400 mW的激光光凝后第1周OCT检查见光凝区视网膜神经上皮层断裂,部分神经上皮层较前增厚，呈白色高反射,光凝后第2、3周前期光凝区神经上皮层明显增厚，呈多层高反射信号，CNV达到高峰，而光凝后第3周后期及第4周部分视网膜已经萎缩变薄。从CNV的形成时间来看，200 mW组于第4周形成CNV,而300 mW和400 mW组于第3周形成CNV，但是300 mW组的CNV在第4周维持CNV的形态利于观察CNV的形态，而400 mW组第4周时神经上皮层开始萎缩，不利于实验观察，考虑200 mW的能量相对较小，导致CNV的成模时间较晚，而400 mW的能量太大，造成了视网膜的损伤，所以还是300 mW的功率适合CNV的造模。任秉仪、Li、Fukuchi、Kim 等的研究结果也证实OCT可以观察CNV的动态进展[4-7]。

3 讨论

因为BN大鼠的脉络膜组织与人的脉络膜结构相似，均含有大量的色素细胞，都可吸收大量光能量，造成视网膜和脉络膜的损伤，从而诱导CNV的形成。以及BN大鼠取材方便，存活率高，而且成熟周期短，成本较低，因此BN大鼠成为临床实验中CNV造模的主要动物来源[8-11]。激光光凝可对老鼠视网膜光凝区产生热效应、光化学效应及器质性损伤效应。激光效应主要是因为激光的光能凝聚到视网膜上，穿破Bruch膜，到达RPE层及脉络膜细胞层面，周围细胞内的蛋白质结构遭到破坏，进而毛细血管的管壁通透性增加，血管内血浆及血细胞渗出，导致激光斑周围的视网膜缺血缺氧，诱导脉络膜滋生新生血管，最终形成CNV。

从FFA实验数据可以看出，功率为200 mW激光的造模渗漏率明显低于300 mW和400 mW，考虑200 mW的功率相对较小，对视网膜的损伤相对较小，所以诱导CNV的成模率较低；而400 mW的功率太大，造成BN大鼠死亡率太高。且从渗漏率可以看出，激光造模的成模率在第3周达到高峰，随后维持稳定，所以功率为300 mW的激光造模是最佳选择。张舒阳等也通过532 nm激光，功率分别选择100 mW、200 mW、300 mW，证实激光功率在300 mW时CNV成模率最高，是激光诱导BN大鼠CNV模型较为理想的激光功率[3]。

根据OCT对CNV的形态学观察所示，200 mW的激光诱导的CNV于第3周开始形成，第4周呈上升趋势，逐渐增多，后期达到稳定期；300 mW的激光诱导的CNV于第2周开始形成，第3周达到高峰，第4周趋于稳定；400 mW的激光诱导的CNV于第1周后期形成，于第2～3周达到高峰，3～4周趋于稳定，第4周后期部分视网膜因结构破坏而萎缩变薄，这一结果同FFA观察结果。唐坤、李学晶及王鑫等通过532 nm激光诱导BN大鼠CNV动物模型，进行切片、染色观察组织形态学的改变，也证实了CNV模型于第3周达到成熟,第4周趋于稳定[2，12-13]，本实验通过观察BN大鼠的FFA和OCT的表现图也得出相关结论，而切片和染色相对FFA和OCT更为复杂，所以可以通过观察FFA和OCT的形态学变化对造模成果与否进行评估，可以节约实验成本并增强实验的可操作性。

综上所述，波长532 nm、光斑直径100 μm、曝光时间100 ms、每眼光凝10～12个点，功率为300 mW的激光诱导BN大鼠的成模率最高，且稳定性最好，值得进一步推广。