大鼠细小病毒检测技术研究进展*

吴定宇 吕瑞青 彭 芳

(1. 大理大学实验动物中心，大理 671003)(2. 成都大熊猫繁育研究基地，成都 610081) (3.大理大学药学与化学学院，大理 671003)

实验动物是生命科学研究的基础和条件。其质量直接影响实验结果的准确性和可靠性。实验动物质量控制的核心是对实验动物携带的微生物和寄生虫进行严格控制。

大鼠细小病毒(Rat Parvovirus，RPV)属于细小病毒科、细小病毒属，单链负链DNA病毒，无囊膜，具有多种血清型。该病毒存在于实验大鼠、野生大鼠和自然环境中，严重危害实验大鼠健康，感染后可造成动物死亡和种群繁殖率下降，造成环境污染。大鼠排泄物和分泌物是主要的传染源。该病毒同时会污染血清、细胞培养物、胚胎等生物样品，尤其是该病毒某些毒株可以污染肿瘤细胞系，对肿瘤细胞造成抑制。为控制该病毒传播，确保实验动物质量，已建立了RPV的多种检测方法。本文就目前大鼠细小病毒检测方法进行综述。

1 大鼠细小病毒毒株分类

RPV分为三个血清型包括RPV-1(Rat Parvovirus Type 1)，KRV(Kilham Rat Virus)和H-1(Toolan’s H-1)[1]。根据我国实验动物微生物学检测的规定[2]， SPF级实验大鼠须检测RPV的KRV株和H-1株。国外对RPV分类与检测范围和我国不同，美国查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)[3]，指出RPV病毒包括RPV-1，RPV-2(Rat Parvovirus Type 2)，RMV(Rat Minute Virus)，KRV，H-1。欧洲实验动物学会联合会(FELASA)[4]要求检测KRV，RMV，RPV和H-1。具体见表1。

表1 不同国家和地区SPF级实验大鼠RPV血清型的检测Table 1 The Serological detection of RPV for SPF rat in different countries and regions

注：●代表检测

Note：●show detection

1959年Kilham和Olivier[5]发现在大鼠肿瘤细胞系中存在一种污染性物质，经分离发现该污染物为病毒，并称为Kilham rat virus(KRV)或Rat Virus(RV)。1960年Toolan等[6]总结前人研究，通过移植人类肿瘤的无细胞(Cell-free)游离成份，会导致仓鼠出现病变，认为这种可滤过性因子是病毒引起的，并从大鼠中分离该因子，移植到人肝癌细胞1(HEp-1)中，最终鉴定为病毒，这种病毒称之为Toolan病毒，通常称之为H-1病毒。

1998年Ball-Goodrich等[7]发现了一种新的大鼠细小病毒PRV-1，通过克隆、DNA序列分析来与其他细小病毒进行比对发现，PRV-1的编码衣壳蛋白的VP1序列和其他细小病毒的VP1序列相似度不超过69%，这就解释了PRV-1的抗原差异性。同时，Ball-Goodrich进行抗体检测分析发现，其有别于KRV和H-1不同的血清型，是第三种血清型。2002年Wan等[8]发现了之前三种大鼠细小病毒不同的RMV毒株，分别是RMV-1a,RMV-1b,RMV-1c,通过基因组核苷酸序列分析和蛋白质氨基酸序列预测的方法，发现三种RMV毒株它们有着共同的启动子和剪切区域，转录起始密码子和终止密码子，它们基因序列的同源性约97%，氨基酸序列的相似性约95%，RMV与KRV和H-1的基因序列差异性小，但是与PRV-1存在较大差异。通过HAI试验发现，RMV有着与KRV、H-1和RPV-1不同的血清型。

2 大鼠细小病毒检测方法

2.1 毒株分离与鉴定

对疑似感染细小病毒的大鼠进行组织取材，取材部位根据可能感染毒株的不同而不同。将取材的组织进行培养，获取上清液，用滤膜过滤，滤过液接种特定细胞进行培养，然后进行病毒检测，如动物回归实验、分子生物学鉴定、血清学鉴定等。

国外一般采用NB-324 K细胞对H-1毒株进行分离培养[9-11],如Leuchs等在研究如何高质量大规模纯化生产H-1毒株时，采用由SV40转化的新生儿肾细胞NB-324 K，来提高H-1作为DNA病毒的复制扩增能力。对KRV株一般采用DMEM培养基培养大鼠肾细胞(NRK细胞)[12-13]，KRV病毒在NRK细胞上会形成吞噬斑，所以可以通过病毒空斑实验检测KRV毒株。

刘先菊等[14-15]分别建立了大鼠细小病毒KRV株和H-1株的细胞培养方法。采用大鼠胶质瘤细胞系(Rat glial cell line C6)培养大鼠细小病毒KRV和H-1，待细胞病变达到测定标准后，进行FITC鉴定所培养病毒的抗原，用HA测定培养物上清效价，用DNA测序鉴定所培养病毒，结果发现采用C6细胞系可以大量培养KRV和H-1。

2.2 血清学检测

血清学检测是诊断和鉴定病毒的重要方法之一。我国实验动物标准规定了四种方法用于大鼠细小病毒的检测[2]：血凝抑制试验(HI)、免疫酶试验(IEA)、免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。

吴小闲等[16]采用HI方法检测大鼠细小病毒RV株(也称KRV)和H-1株，均发现存在阳性感染的情况。贺争鸣等[17]采用ELISA、IEA和HI这三种方法进行比较，检测了大鼠细小病毒RV株，发现ELISA和IEA在重复性和抗体阳性检出率方面均优于HI(P<0.05)。王翠娥等[18]采用ELISA方法对2012年至2013年国内36家单位的大鼠和小鼠血清进行病毒抗体检测，检测出来的阳性样品再用免疫荧光试验(IFA)进行复检，大鼠细小病毒检测项目按照查尔斯河实验室的检测项目进行，发现大鼠细小病毒毒株RPV、H-1、KRV、RMV均呈阳性。李晓波等[19]报道，在16个实验动物质量检测实验室进行比对中，14个实验室采用ELISA，占87.5%，3个实验室采用IFA方法，另有1个实验室同时采用IFA和ELISA方法。目前，对大鼠细小病毒进行检测的进口ELISA试剂盒一般采用Charles River、Biotech Trading Partners、XpressBio Life Science等公司产品。国产ELISA大鼠细小病毒检测试剂盒主要采用中国食品药品检定研究院产品。付瑞等[20]建立了H-1细小病毒抗体ELISA检测方法，经试验发现与大鼠KRV病毒有交叉反应。

不同国家或地区检测大鼠细小病毒毒株类型不同，初检和复检的方法也有所差异。如美国查尔斯河实验室的动物诊断研究服务部[21]对近五年北美地区和西欧(主要是法国)的大鼠和小鼠流行病学情况进行研究。共收集了50万份小鼠样品和8万份大鼠样品。采用血清学方法检测大鼠细小病毒(病毒毒株为KRV、RMV、H-1和RPV)。初步检测采用多重免疫荧光方法(Multiplexed Flurometric Immuneno Assay，MFIA)或ELISA，对于检测出的阳性样品复检采用IFA或HAI，具体见表2。

表2 SPF级大鼠细小病毒血清学检测(查尔斯河实验室)Table 2 The Serological detection of rat parvovirus for SPF rat in Charles River Laboratories

Manjunath等[22]对印度26个实验动物机构的大鼠和小鼠进行了血清学调查，每个机构分别采集5份大鼠和5份小鼠血样，在130份大鼠血样中用ELISA方法检测大鼠细小病毒KRV株和RPV株，发现RPV感染率在5.38%，KRV无感染。Mcinnes等[23]在2004年到2009年间从澳大利亚、新西兰和新加坡等国家的大学、研究中心、科研机构获取SPF级的大鼠和小鼠，采用过量CO2安乐死，在收集的血清和组织样品中检测出大鼠细小病毒，毒株包括H-1，KRV，RMV和RPV。检测方法为首先进行ELISA检测，对于ELISA检测结果不确定或可疑的，再用IFA进行重测。Liang等[24]、 Zenner和Reqnault[25]以及Schoondermark等[26]对不同国家或地区大鼠和小鼠进行病毒流行调查和血清学筛查，均采用ELISA作为大鼠和小鼠细小病毒的首选检测方法。

综上所述，国内外实验室在检测大鼠细小病毒毒株种类上存在差异，但普遍采用血清学检测方法，ELISA使用最多。对于某些血清样品结果的不确定性，通常采用IFA或HAI进行复检，以对检测结果进行确认。

2.3 分子生物学检测

采用普通PCR检测大鼠细小病毒，如Besselsen等[27]采用PCR技术来检测H-1和KRV毒株，通过设计引物来扩增H-1和KRV编码衣壳蛋白的VP基因为目的片段。Wan等[28]采用PCR检测RPV和RMV病毒，设计引物分别扩增RPV的NS区序列和RMV的VP区序列目的基因。

除普通PCR方法之外，我国学者还采用多重PCR方法进行大鼠细小病毒的分子生物学检测。李晓波等[29]建立对大鼠H-1和KRV毒株检测的双重PCR方法，分别设计特异性引物，扩增目的片段是病毒的衣壳蛋白基因编码区(VP)，并确定2对引物无交叉反应，实验结果发现能够高效检测大鼠细小病毒的感染。饶丹等[30]根据大鼠细小病毒基因特异性，采用双重PCR的方法，来检测H-1、KRV、RMV和RPV四种大鼠细小病毒，在VP2基因筛选一对用于特异扩增RPV毒株的引物，在NS1基因设计一对用于扩增H-1、KRV和RMV的引物，敏感实验表明，双重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL。

以高通量测序方法为基础，可以进行不同毒株的大鼠细小病毒检测。传统的基因测序技术采用Sanger法，存在成本高、耗时及测序样品受限等不利因素，Life Sciences公司发明了高通量测序技术又称第二代测序技术(next generation sequencing,NGS)可以对上百万DNA分子进行测序检测。查尔斯河实验室已经开展了商业化高通量试验—检测DNA病毒服务。Höfler等[31]针对啮齿类实验动物存在的病毒、细菌的监控，开发出一种新的高通量多重PCR分析方法，称之为rDVF(rodent DNA virus finder)，可以同时鉴定24种大鼠和小鼠DNA病毒感染情况，其中大鼠细小病毒包括H-1、RPV、KRV和RMV。

Luminex液相芯片分析技术可进行多种微生物和病毒的检测，其技术包括xMAP技术和xTAG技术。xTAG技术使用专有通用标签系统，易于进行优化和核酸检测开发，Luminex公司所提供的基于xTAG技术的核酸检测，包括感染性疾病和基因检测相关的临床诊断检测。如对多种肠道病原体和呼吸道病毒均可以采用xTAG技术进行检测[32-33]。Xu等[34]发明一种阵列式xTAG检测方法，可同时检测大鼠细小病毒KRV、H-1、RPV和RMV，并对这四种毒株予以区别，通过xTAG技术和常规PCR技术检查了50个临床样品，结果显示高度一致。

3 结语

病毒分离培养和观察鉴定被认为是病原微生物检测的“金标准”(Gold Standard)，但缺点是检测周期长，速度慢，对操作要求较高且成本也高。

血清学检测是现行的实验动物国家标准规定的方法，目前各实验室普遍采用ELISA进行大鼠细小病毒初筛，复检时用IFA或HIA进行。虽然ELISA和IFA检测敏感性好，但是由于大鼠细小病毒毒株的非结构蛋白相对保守，导致抗体会产生交叉反应，因此ELISA和IFA检测的特异性较差，不易将不同毒株的细小病毒区分开来。HIA检测有一定特异性，但由于其只针对抗体直接作用于不同毒株的血细胞凝集素上，形成血凝抑制反应，因此敏感性较低。

以PCR为主的分子生物学技术具有高效、快速、灵敏的优点，但该技术也存在有假阳性和假阴性的缺点。目前该技术及衍生技术广泛应用于国内外啮齿类实验动物病毒检测中。多重PCR及液相芯片分析技术等方法可以快速区分不同毒株的大鼠细小病毒。

细小病毒是严重影响实验大鼠健康的病毒之一，因此建立起灵敏、准确、操作方便的检测方法，是准确检测和有效控制该病毒传播的重要手段。