无乳链球菌中可接合性转移元件的检测及携带菌株的分子流行特征调查

朱东安， 周凯鑫， 常 东， 孙景勇

无乳链球菌亦称为B族链球菌（group BStreptococcus），常可引起肺炎、泌尿系统感染、软组织感染等，无乳链球菌也是女性泌尿生殖道的一种重要条件致病菌，可垂直传播感染胎儿，也是婴儿早期严重感染的主要原因[1]。临床上无乳链球菌对青霉素具有高度敏感性，而对于青霉素过敏的患者克林霉素、红霉素或左氧氟沙星是重要的替代用药，但无乳链球菌对这些药物具有较高的耐药率[2]。通常认为耐药质粒的传播是细菌耐药性播散的重要机制，然而近年来随着测序技术的发展，很多测序结果显示一种广泛存在于细菌中的可接合性转移元件（ICE）也在细菌耐药性的转移过程中扮演了重要角色[3]。

本研究将对分离自临床标本中的无乳链球菌进行ICE检测并对ICE阳性菌株的耐药性和分子流行特征进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2017年8月－2018年4月上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科临床分离的无乳链球菌178株（剔除重复株），其中分离自尿路感染患者中段尿117株（86株来自门诊患者，31株来自住院患者）、阴道分泌物45株（来自孕前筛查孕妇）、前列腺液12株（来自门诊患者），血培养4株（来自住院患者）。接合试验受体菌为1株分离自临床的无乳链球菌（sag158），其对红霉素敏感、对左氧氟沙星耐药，经三代全基因组测序证实其不含ICE 结构，多位点序列分型（MLST）分型为ST-19型（GenBank： CP019979）[4]。

1.1.2 主要试剂和仪器 药敏纸片为英国OXOID公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂为天根生化科技（北京）有限公司产品；VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统为法国生物梅里埃公司产品；Thermal Cycler PCR 仪和CHEF-DR Ⅲ脉冲场凝胶电泳仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及DNA模板提取 收集的菌株由VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统进行无乳链球菌确认鉴定。从孵育18～24 h的血琼脂培养基上挑取10～12个菌落通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取临床分离的无乳链球菌基因组DNA备 用。

1.2.2 筛选可能携带ICE的菌株 以PCR方法筛选无乳链球菌中ICESa2603家族ICE的酪氨酸重组酶基因tyr及其特异性插入位点基因rplL，引物根据GenBank上公布的序列自行设计。以PCR方法筛选无乳链球菌中类ICESa2603家族ICE的丝氨酸重组酶基因SR以及其特异性插入位点基因rumA，引物根据GenBank上公布的序列自行设计。见表1。扩增产物测序结果通过BLAST与GenBank上公布的tyr、rplL基因，SR、rumA基因进行比对。

表1 ICE PCR扩增引物Table 1 The primers used in ampli fication of ICEs

1.2.3 MLST 根据Jones等[5]撰写的无乳链球菌MLST操作方案设计引物，通过PCR扩增无乳链球菌的7个管家基因：adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt。PCR扩增产物委托上海迈浦有限公司测序，测序结果与PubMLST数据库进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其ST型。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 根据Elliott等[6]发表的无乳链球菌PFGE操作方案，将包埋有细菌DNA的胶块经裂解、用限制性内切酶SmaI处理后电泳，电泳参数为电压6 V/cm，夹角120°，温度14 ℃，电泳时间18 h，沙门菌H9812作为分子量标 准。

1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散法对无乳链球菌菌株进行药敏试验，根据 CLSI 2018年标准判读结果，药敏结果采用WHONET 5.6软件进行分析，耐药率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.2.6 接合试验 根据ICE筛选阳性的临床无乳链球菌的药敏试验结果，选择其中15株对红霉素耐药、左氧氟沙星敏感的菌株作为受体菌，无乳链球菌sag158（红霉素敏感、左氧氟沙星耐药，见菌株来源）作为受体菌进行接合试验，具体方法见文献 [4] 。挑取在双抗性平皿（含有红霉素和左氧氟沙星）上单个生长菌落，进行菌种鉴定、PFGE、 药敏试验、PCR检测ICE重组酶基因及MLST分型以判断接合试验是否成功。

2 结果

2.1 无乳链球菌中ICE的检测

通过PCR筛选不同类型ICE的插入位点以及整合酶基因，结果发现178株无乳链球菌中27株（15.2%）携带ICE（tyr、rplL基因阳性或/和SR、rumA基因阳性）。其中属于ICESa2603家族的有14株（7.9%）（tyr和rplL基因阳性）；属于类ICESa2603家族的有19株（10.7%）（SR和rumA基因阳性）；两类ICE筛选皆为阳性的有6株（3.4%）（tyr、rplL基因和SR、rumA基因均阳性）。

2.2 MLST分型

本研究通过PCR扩增无乳链球菌的7个管家基因将27株携带ICE的菌株分为9种ST型别，其中ST-12型10株（37.0%），ST-27型4株（14.8%），ST-24型3株（11.1%）， ST-19型3株（11.1%），ST-17型2株（7.4%），ST-10型2株（7.4%），另外ST-41、ST-164、ST-15型各1株（3.7%）。

2.3 药敏试验结果

所有178株无乳链球菌对青霉素均敏感，对红霉素、克林霉素、四环素和左氧氟沙星的耐药率分别为56.2%、41.6%、77.5%和34.3%，其中27株ICE阳性的无乳链球菌对上述4种抗菌药物的耐药率分别为77.8%、59.3%、92.6%和14.8%；151株ICE阴性的无乳链球菌对上述4种抗菌药物的耐药率分别为52.3%、38.4%、74.8%和37.7%。见表2。

表2 携带ICE和非携带ICE的无乳链球菌对抗菌药物的耐药率Table 2 Antibiotic resistance of ICE-carrying and non-ICE-carrying S. agalactiae（%）

2.4 接合试验结果

药敏结果显示15株红霉素耐药ICE阳性的临床无乳链球菌中，10株菌成功地发生了红霉素耐药性接合转移，见表3；PFGE结果显示10株结合子的PFGE分型与受体菌（sag158）一致而与供体菌（临床菌株）不同，见图1；PCR检测重组酶基因及结合子MLST分型证实这10株结合子中均含有相关供体菌中的重组酶基因，且结合子的ST分型与受体菌（sag 158）一致（均为ST-19）而与供体菌的临床菌株不同（7株ST-12，3株ST-27）。见表4。

3 讨论

目前研究发现在链球菌（包括无乳链球菌）中与耐药性相关的ICE主要为ICESa2603家族和类ICESa2603家族两类[7-8]。ICESa2603是首次在无乳链球菌 2603 V/R中发现，其大小为54 kb左右[9]，随后，在来自欧洲和亚洲的动物及人类临床分离的链球菌中检测到ICESa2603家族中的其他ICE成员，由此推断ICESa2603家族的成员在链球菌属中已经播散存在并且能够在链球菌属中水平转移[8]，随着测序技术的发展，其数量及宿主范围可能会进一步扩大。

ICESa2603家族的ICE包含30个保守的核心基因，在基因结构间有3个位点，用于在所有ICE中插入可变DNA。ICESa2603家族编码酪氨酸整合酶基因tyr，其在宿主菌的特异性插入位点为染色体上rplL基因。而类ICESa2603家族的ICE含有ICESa2603家族的大部分核心基因（30个中的28个），但它们编码丝氨酸整合酶基因SR，其在宿主菌的特异性插入位点为染色体上rumA基因[7]。本研究通过PCR筛选这两类ICE家族中特定整合酶基因（tyr和SR）及其特异性插入位点基因（rplL和rumA）了解临床分离的无乳链球菌中ICE的流行情况，结果显示两类ICE家族的总检出率达15.2%

（27/178），其中ICESa2603家族为7.9%，类ICESa2603家族为10.7%，有6株（3.4%）同时携带有两个家族的ICE，说明ICE在无乳链球菌中有一定的分布，需要引起我们的注意。

表3 10株接合成功的红霉素耐药无乳链球菌及其受体菌、接合子的药敏结果Table 3 Antibiotic susceptibilities of 10 erythromycin-resistant S. agalactiae strains and their transconjugants

图1 部分接合成功的无乳链球菌及受体菌、接合子的PFGE结果Figure 1 PFGE patterns of some S. agalactiae donor strains， recipients， and their transconjugants

表4 10株接合成功无乳链球菌及其受体菌、接合子MLST分型和ICE整合酶PCR结果Table 4 MLST typing and PCR detection of integrase genes in 10 S. agalactiae strains and their transconjugants

MLST结果表明，在本研究ICE阳性的无乳链球菌中主要的克隆型为ST-12型（37.0%），其次为ST-27型（14.8%）、ST-24型（11.1%）和ST-19型（11.1%）。而来自上海、广州和北京的研究均显示临床分离的无链球菌（未区分是否携带ICE）其MLST分型主要为ST-19型[10-12]，由于本研究未对ICE阴性无乳链球菌进行MLST分型的检测，且ICE筛选阳性菌株的总样本量较少，ICESa2603家族和类ICESa2603家族中的ICE在无乳链球菌中的分布与ST-12型克隆菌株是否具有相关性，还需进一步探讨。

ICE能够自身编码重组和接合转移所需的全部功能，并携带多样化附属功能基因（如抗生素和重金属抗性基因、毒力基因等）从供体菌的染色体自身切割环化后接合重组到受体菌染色体某些特定或非特定区域[3]。ICESa2603家族和类ICESa2603家族的ICE可变区中往往携带耐重金属、红霉素、四环素及氨基糖苷类等药物的基因，如erm(B)、tet(O)、aphA等[7]，目前已报道的这两类携带上述耐药基因的ICE大多数经体外试验证实是可接合转移的，从而可能导致临床菌株耐药性扩散。如本研究的接合试验显示：所选取的15株ICE阳性且红霉素耐药的临床无乳链球菌中，有10株可发生ICE和红霉素耐药性的同时接合性转移，而在前期研究中我们对其中的1株供体菌（sag37）及其结合子进行了染色体高通量测序分析，首次发现报道了一种新的类ICESa2603家族的ICE，ICE sag37，该ICE插入在染色体上且同时携带有红霉素、四环素及氨基糖苷类耐药基因[7]。另外，本研究通过比较携带ICE菌株和非携带ICE菌株的药敏情况发现，前者对红霉素、克林霉素和四环素的耐药率（分别为77.8%、59.3%、92.6%）均显著性高于后者（分别为52.3%、38.4%、74.8%），P＜0.05，这进一步证实ICE在临床分离无乳链球菌对红霉素、克林霉素和四环素的耐药扩散中可能扮演了一定角色。不过有意思的是本研究发现ICE阳性菌株对左氧氟沙星的耐药率（14.8%）却显著性低于ICE阴性菌株（37.7%），P＜0.05，一个可能的解释是：革兰阳性球菌中，左氧氟沙星耐药主要是由染色体DNA中喹诺酮耐药决定区域（QRDR）上的点突变引起的，该耐药性与ICE的关联不大，本研究中ICE阳性菌株以ST-12型多见，而多个研究均发现ST-19型无乳链球菌通常表现为左氧氟沙星的高耐药率，而其他ST型菌株的耐药率较低[12-13]，其原因尚需进一步研究。

综上所述，ICE在临床分离的无乳链球菌中具有较高的检出率，其可能在红霉素、四环素等耐药基因的水平传播上起着一定作用，ICE阳性菌株中的主要克隆型为ST-12型。