新疆地区鲍曼不动杆菌多重耐药菌株同源性分析

李 娟， 姚新宝， 郭淑丽， 杨丽玮， 罗 斌， 王昌敏， 马慧霞， 西丽娜依·买买提

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）属不发酵糖革兰阴性杆菌，是引起医院感染的重要条件致病菌之一。近年来，由鲍曼不动杆菌引起的医院感染逐年增加，尤其是重症监护室（ICU）内的感染更严重[1-2]。鉴于新疆地域广阔，仅乌鲁木齐市临床标本无法反映全疆多重耐药鲍曼不动杆菌克隆传播趋势。本项研究收集新疆9地（州）医院ICU多重耐药鲍曼不动杆菌72株，针对其耐药性及同源性进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集全疆9地（州）2016年5月－2017年10月72株多重耐药鲍曼不动菌，剔除同一患者相同部位的重复菌株。其中，乌鲁木齐38株、吐鲁番4株、伊犁3株、石河子2株、昌吉7株、库尔勒4株、阿克苏5株、喀什3株、和田6株。菌株全部来源于住院患者：ICU 30株、外科ICU（SICU）18株、呼吸ICU（RICU）8株、烧伤创面修复科9株、呼吸科5株、神经外科ICU（NSICU）2株。分离自痰液40株、血液11株、伤口分泌物11株、静脉导管尖端6株、气管抽吸物4株，所有收集菌株经VITEK 2-Compact系统初步鉴定为鲍曼不动杆菌复合群后，严格按照《全国临床检验操作规程》[3]第4版鉴定到种，置-80 ℃低温冰箱保 存。

1.1.2 试剂和耗材 生化试验管（购自杭州微生物试剂有限公司）、MO BIO UltraCleanTM微生物DNA 提取试剂盒、DiversiLab 不动杆菌试剂盒、DiversiLab 微流体芯片试剂盒和DNA 芯片（ 法国生物梅里埃公司）、 DNA聚合酶（N8080160，购自Thermo Fisher公司）、GN革兰阴性杆菌鉴定卡片、革兰阴性药敏卡片（ 法国生物梅里埃公 司）为主要试剂耗材。

1.1.3 仪器 VITEK 2-Compact 微生物鉴定药敏分析系统、VITEK MS全自动快速微生物鉴定质谱仪（ 法国生物梅里埃公司）、Agilent 2100 生物分析仪（美国Agilent Technologies 公司）、振荡器（Vortex Genie 2 Vortex）、ABI 2720Thermal Cycler PCR仪、可见分光光度计（NanoDrop ND-1000）为主要实验仪器。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用VITEK 2-Compact 系统药敏卡（GN09），药敏卡如无该抗菌药物即采用纸片扩散法（头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、多黏菌素B、替加环素、米诺环素、甲氧苄啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、氨苄西林-舒巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦）。药敏试验采用2016年CLSI推荐的标准执行。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌ATCC 35218、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603购自上海汉尼生物技术有限公司。每周用大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC Ultra 27853标准菌株作药敏质控。

1.2.2 DiversiLab系统分型方法 DNA提取：在血平皿上挑取单个菌落使用MO BIO UltraCleanTMMicrobial DNA提取试剂盒提取细菌DNA。经分光光度计NanoDrop 1000检测DNA浓度，使用蒸馏水调整DNA的浓度为25～50 mg/L。

1.2.3 目标片段扩增 使用DiversiLab不动杆菌DNA指纹图谱试剂盒，配制25 μL PCR扩增体系；使用2720 PCR仪扩增，预变性94 ℃ 2 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s为1个扩增循环，共扩增35个循环；最后70 ℃延伸3 min。

1.2.4 PCR扩增产物的检测 将扩增产物与凝胶按照顺序注入含微流控芯片LabChips，使用Vortex Genie 2 振荡器振荡制备好的微流控芯片1 min，放入Agilent 2100生物分析仪对微流控芯片LabChips内的扩增产物片段进行检测。

1.2.5 数据分析 通过独立的、安全的DiversiLab互联网分析软件，扩增产物的结果按照分组实时分析DNA、指纹图谱数据，在线生成报告。相似性系数无差异，条带无差异，相似性系数97%以上表示来源于同一克隆；仅有1～2个条带差异，相似性系数95%～97%，疑似暴发，表示有亲缘关系；不同来源的3个或以上条带差异，相似性系数95%以下，表示无亲缘关系[4]。

2 结果

2.1 全疆鲍曼不动杆菌临床资料

符合本研究多重耐药鲍曼不动杆菌72株，临床诊断以术后感染为主；标本采样时间为2016年5月－2017年10月。其他地区菌株除和田2株分布在呼吸科外，其他菌株来源于重症医学科；临床诊断以肺部感染为主；所有痰液标本经涂片均判定为合格标本。

2.2 药敏试验结果

72株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌均为多重耐药菌，见表1。

2.3 全疆菌株同源性分析

根据扩增片段的多态性比较菌株间相似性。以95%作为标准可分为4型：1型为主要克隆，占59.7%；其次是3型，占16.7%；4型和2型分别为12.5%和11.1%。其中3型是乌鲁木齐市独有的克隆株；2型主要分布在乌鲁木齐市、和田地区；而1型在全疆9个地区均有分布，其中乌鲁木齐市占46.5%；4型主要分布于昌吉、和田地区，呈现特有的显著条带。1型相似性系数为95%～97%，而2、3、4型相似性系数均大于97%。通过列表，可以看出在新疆地区引起各种感染的鲍曼不动杆菌主要是1型克隆菌株。见表2。

表1 72株多重耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物耐药率和敏感率Table 1 Susceptibility pro file of 72 multi-drug resistant Acetobacter baumannii strains（%）

表2 新疆地区72株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌的同源性和所致的感染性疾病Table 2 Homology among the 72 clinical strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from Xinjiang and the related infections

2.4 1型与3型克隆株耐药性比较

鉴于1型克隆株为全疆流行株，而3型克隆株是乌鲁木齐市独有，比较其耐药结果显示：1型克隆株耐药率稍低于3型，除替加环素2株耐药，多黏菌素B 1株耐药全部来源于3型克隆株，对其他抗菌药物耐药率的比较。见表3。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是近年来全球范围内造成医院感染流行的主要病原菌之一[5]，特别是耐碳青霉烯类菌株，给临床治疗带来很大的困难。有文献报道鲍曼不动杆菌具有较强的生物膜形成能力，当细菌以生物膜形式存在时，耐药性及致病性明显增强[6-7]。新疆自治区细菌耐药监测网专家委员会数据分析，2016年鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率为56.4%，而我院为75.5%，也高于2015年CHINET细菌耐药性监测已接近70%的报道[8]。另外，住院时间延长以及使用昂贵的抗生素，多重耐药菌所致医源性感染发生率、病死率和医疗费用均明显增高。

表2 （续）Table 2（continued）

表3 多重耐药鲍曼不动杆菌1型与3型克隆株对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility pro files of Clone 1 and Clone 3 multidrug resistant Acinetobacter baumannii strains（%）

表3 （续）Table 3（continued）（%）

本研究分别从全疆9地（州）医院ICU收集符合要求的72株多重耐药鲍曼不动杆菌，目的是了解各地区医院耐药克隆株分布情况，其研究结果能为全疆各级医院院感管理监控部门进行监控提供重要的理论依据。诸多学者相继报道各种基因分型方法优缺点[9-11]。本研究采用DiversiLab 系统，参照曲燕燕等[12]报道分析，该方法具有操作简便、高通量和分型能力强等优势。基于重复序列PCR引物与许多分布在整个基因组上特异性的重复序列配对；经过PCR扩增形成多个不同长短的片段，这些扩增的片段根据其质量差异，经电泳分析，得到由多条带组成、强弱不一、专一性的重复序列PCR DNA指纹图谱。通过此方法对全疆多重耐药鲍曼不动杆菌进行同源性研究，结果分为4个不同的克隆型：①1型基因型在全疆9地（州）检测到同一来源的多重耐药鲍曼不动杆菌43株，各地区均有分布。实验结果显示：分布于乌鲁木齐20株、阿克苏5株、吐鲁番4株、喀什3株、库尔勒4株、石河子2株、伊犁3株、和田和昌吉各1株，说明在全疆不同地区、医院、病房或同一地区、医院、病房中发生多重耐药鲍曼不动杆菌的播散。是否因碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的克隆传播还有待进一步研究。 ②3型为乌鲁木齐独有克隆株，临床资料显示2017年8月从SICU不同烧伤患者送检血液、分泌物、痰液标本中同时培养出多重耐药鲍曼不动杆菌5株；同一时间段又从SICU另1例患者引流液标本中分离1株多重耐药鲍曼不动杆菌，该患者临床诊断椎管狭窄； 8月底9月初烧伤患者全部转入烧伤创面修复科，从送检静脉导管尖端、分泌物、痰液标本培养出与SICU相同耐药菌；同时从该科室电击伤患者送检的分泌物标本，也同样培养出与SICU相同耐药菌，根据扩增片段的多态性比较菌株间相似性，相似性系数在95%～100%，提示检测到同一来源多重耐药鲍曼不动杆菌；说明该克隆株在SICU有交叉传播、SICU与烧伤创面修复科病房有交叉传播。其中有1株克隆株来源于和田地区医院ICU，可能与患者转院有关。③ 2型基因型出现在乌鲁木齐和和田地区，此群特点在不同ICU（RICU、SICU、NSICU）患者标本中分离出6株相同基因型，并且3个ICU分布在医院不同区域和楼层，其次ICU不陪护，医护人员出入病房也做好个人防护，但患者有转科情况，导致传播的主要因素与环境污染、手卫生有着密切关系，与刘延媛等[13]报道一致。同时发现SICU存在不同菌株，提示可能发生不同克隆株在医院的交叉感染。和田有2株菌，分离自呼吸科病房，属同一基因型，提示乌鲁木齐与和田也具有同源性。④4型基因型分布于昌吉、和田地区，呈现特有的显著条带；通过临床资料分析： 2016年8月10日分离自呼吸科病房，标本为痰液，临床诊断肺部感染；同年8月23日分离自ICU，标本为痰液，临床诊断慢性支气管炎急性发作；同年9月6日分离自呼吸科病房，标本为痰液，临床诊断肺气肿，以上3株耐药鲍曼不动杆菌来自和田医院，相似性系数达99%，说明来源同一克隆菌株，存在于前例感染患者出院20 d后，在ICU的患者标本中及出院1个月后，仍然在同一科室患者标本中检出具有同源性的多重耐药鲍曼不动杆菌，提示病房环境卫生消毒不彻底，未能完全杀灭多重耐药鲍曼不动杆菌；此克隆株为和田地区流行株。昌吉地区共有6株菌，属4型克隆株，全部菌株来自ICU，入院与出院患者之间相差4～5个月，标本为痰液，临床诊断重症肺炎、肺部感染；提示ICU患者之间有交叉感染，表明昌吉与和田地区具有同源性，也是昌吉地区的主要流行株。同时比较1型与3型克隆株耐药率，3型略高于1型。

综上所述，分析全疆克隆株流行特点，各地（州）医院要高度重视，特别是对需要转院、转科时，进行病房环境中鲍曼不动杆菌的监测；切断多重耐药鲍曼不动杆菌在全疆地区之间、医院之间、科室之间、病房内的扩散传播及散在传播，防止交叉感染。