血清长链非编码RNA LNC00993联合MMP-2和CEA在食管癌诊断和预后中的研究

李筱，张静，向慧敏

(汉中市中心医院精准医学诊断中心，陕西 汉中 723000)

随着人们饮食习惯的改变，我国部分省市食管癌的发病率呈现出上升趋势。早期食管癌症状不典型甚至无症状，患者不易察觉，当出现进行性吞咽困难或咽下食物时有胸痛的感觉等典型症状时，患者多已进展到中晚期[1]。目前，食管癌的主要筛查手段是食管脱落细胞学检查，但由于其敏感性和特异性均较低、且具有一定的创伤性，无法在人群中推广使用[2]。值得注意的是，尽管食管癌的诊断和治疗已有较大进展，但其预后仍不尽如人意，这很大程度上是由于缺少可靠易行的早期筛查手段。

长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)与癌症的发生、发展及转移密切相关[3]。近年来，研究发现LNC00993在食管癌癌组织中存在异常表达，对食管癌癌具有潜在的诊断价值。基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是一类重要的水解细胞外基质的蛋白水解酶，参与到肿瘤的生长与转移过程[4]。本研究通过比较食管癌患者与健康人群的LNC00993、MMP-2与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平，旨在探究三者对食管癌的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集本院2015年1月到2016年12月确诊的食管癌患者120例作为病例组，患者均为首次住院且经内镜组织学检查确诊。其中上段食管癌19例，中段食管癌66例，下段食管癌35例；I-II期食管癌患者31例，III-IV期患者89例；鳞癌96例，腺癌13例，腺鳞癌11例；高分化癌31例，中分化癌66例，低分化癌23例。选取同期在本院行健康体检的健康人群120例作为对照组。本研究的开展经医院伦理委员会批准。从患者入院开始对纳入的120例食管癌患者进行随访，随访日期截止至2018年7月，随访时间为18到42个月。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2 临床资料与样本的采集

由研究人员记录患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史等基本信息。使用促凝采血管收集经禁食10 h以上食管癌患者接受治疗前和健康对照者入院体检时的静脉血5 mL。收集的标本在1 h内于4 ℃条件下以3 500 g离心力离心10 min，收集上层血清，并放入-80 ℃冰箱保存备检测。

1.3 血清CEA与MMP-2水平的检测

血清CEA的检测采用化学发光法，试剂由上海百蕊生物科技有限公司提供。质控品采用英国朗道公司肿瘤高、低值质控品，质控判断标准为Westgard多规则分析。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测每组对象血清MMP-2水平。步骤如下：所有标本经稀释(1∶100)后依次加入微孔板中与抗体室温孵育40 min(同时加入MMP-2浓度为100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL的3个标准品、阳性和阴性对照)，洗板5次，在避光条件下加入酶标记的单抗室温孵育40 min，再洗板5次，加入底物反应15 min后终止反应，于美国赛默飞世尔公司Nanodrop ND2000分析仪上检测吸光值(A)。MMP-2检测试剂盒由上海百蕊生物科技有限公司提供。同时计算血清CEA与MMP-2检测的批内、批间变异系数(coefficient of variation，CV)，以评估实验的重复性和精确度。

1.4 LNC00993表达水平的检测

按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行血清总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。荧光定量PCR循环条件：95 °C变性5min；95 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 30s，45个循环，每组设置3个复孔。使用的LNC00993与GAPDH引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。

表1 LNC00993和GAPDH的引物序列

1.5 患者治疗

纳入的I-II期食管癌患者均给予手术切除并于术后行放化疗治疗；III-IV期患者均采用放化疗保守治疗方案。所有患者化疗均采用紫杉醇-顺铂方案：于术后第7、14 天 静脉滴注多西紫杉醇75 mg/m2各1次，1 h；第1、7、14 天 静脉滴注顺铂25 mg/m2各1次。所有患者放疗均采用调强放疗方案：患者固定于治疗床架后，设置体表标志并行薄层增强CT扫描定位，患者于平静呼吸下行强化薄层无间隔连续扫描。患者均治疗4个月。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象的临床基本信息与血清LNC00993、MMP-2与CEA表达水平

病例组中男性86例，平均年龄(56.3±3.8)岁，其中57人有吸烟史、71人有饮酒史；对照组中男性82例，平均年龄(57.8±3.5)岁，其中55人有吸烟史，68人有饮酒史。两组间在年龄、性别、吸烟史、饮酒史的差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组的血清LNC00993、MMP-2与CEA水平均显著高于对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。血清LNC00993、MMP-2与CEA检测的批内CV值分别为3.5%和2.4%，批间CV值分别为4.6%和2.8%，均小于5%，提示本实验样本检测具有良好的重复性和精确度。

组别病例组(n=120)对照组(n=120)t值P值LNC00993(-log)121.5±7.511.7±1.27.437<0.001MMP-2,pg/mL43.5±4.317.3±1.44.684<0.001CEA,ng/mL22.5±2.13.2±0.65.763<0.001

2.2 LNC00993、MMP-2和CEA水平与食管癌临床病理特征的关系

LNC00993、MMP-2与CEA水平与食管癌患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤部位等均无明显关系(P>0.05)，而与食管癌的分期、分化程度及组织学类型显著相关(P<0.05)。且LNC00993、MMP-2与CEA在中晚期食管癌、食管腺鳞癌及低分化食管癌患者中的水平增高最为显著，见表3。

表3 LNC00993、MMP-2和CEA与食管癌临床病理特征的关系

2.3 LNC00993、MMP-2和CEA对食管癌的鉴别诊断

ROC曲线分析显示，血清LNC00993、MMP-2和CEA在区分食管癌与对照组的AUC分别为：0.898(95% CI：0.771～ 0.961，P<0.001)、0.814(95% CI：0.710～0.922，P<0.001)和0.649(95% CI：0.571～ 0.758，P=0.001)；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度及特异度分别为：灵敏度/特异度分别为：80.9%/84.6%、76.3%/81.5%和69.0%/58.4%；诊断界值分别为：80.6(-log)、35.5 pg/mL和5.8 ng/mL。联合LNC00993、MMP-2和CEA在区分食管癌与对照组的AUC为0.937(95% CI：0.842～0.981，P<0.001)，灵敏度92.7%，特异度81.8%，见图1。

2.4 血清LNC00993、MMP-2和CEA水平对食管癌患者的生存分析

采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存曲线分析，见图2。I-II期和III-IV期食管癌患者分别依据LNC00993、MMP-2和CEA水平的中位数被分为高LNC00993与低LNC00993组、高MMP-2与低MMP-2组和高CEA与低CEA组。III-IV期患者中，相比低LNC00993组，高LNC00993组患者的生存时间显著缩短(χ2=4.138，P=0.047，图2A)；相比低MMP-2组，高MMP-2组患者的生存时间显著缩短(χ2=11.369，P=0.002，图2C)；而高CEA组与低CEA组间的生存时间差异无统计学意义 (χ2=0.258，P=0.715，图2E)。I-II期患者中，相比低LNC00993组，高LNC00993组患者的生存时间显著缩短(χ2=7.265，P=0.020，图2B)；相比低MMP-2组，高MMP-2组患者的生存时间显著缩短(χ2=9.694，P=0.002，图2-D)；而高CEA组与低CEA组间的生存时间差异无统计学意义 (χ2=0.137，P=0.924，图2F)。

3 讨论

目前，食管癌的主要筛查手段是脱落细胞学检查，但该技术的临床开展仍有诸多不足之处，例如：该检查的技术含量相对较高，对临床医生的技能要求高；该检测的敏感性和特异性均较低，漏诊率较高；具有创伤性。这些均阻碍了该技术在人群中推广使用。

近年来的研究表明，LncRNA可通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在转录或转录后水平，以顺势调控或反式调控的方式，调节基因的表达，参与几乎人类所有的生理及病理性生物学过程[5-6]。关于lncRNA与食管癌国内外已有多个研究报道。Chen等[7]发现lncRNA SBF2-AS1在食管鳞状癌细胞中的表达显著上调，且在SBF2-AS1被沉默抑制后食管鳞状癌细胞的增殖和侵袭能力明显降低，而SBF2-AS1因此被认为是一种新的食管鳞状癌生物标志物。Huang等[8]通过对28例食管鳞状癌患者癌和癌旁组织中lncRNA MEG3表达水平的检测发现，MEG3基因的表达在癌组织中显著降低，进一步的机制研究发现MEG3能够诱导癌细胞的凋亡。上述研究提示，lncRNA的差异表达参与了食管癌的发生、发展过程。值得注意的是，Chen等[9]利用LncRNA芯片技术与生物信息学分析，筛选出了可能调控乳腺癌发生发展的关键lncRNA—LINC00993，其在乳腺癌组织和细胞中显著高表达，且在乳腺癌细胞株中过表达LINC00993后，细胞的增殖活性及克隆形成能力明显增强、凋亡率显著降低。而关于LINC00993在食管癌中的表达情况未见报道，其是否具有成为早期肿瘤诊断标志物的潜力是本次研究需要探讨的。本研究通过对120例食管癌患者的分析结果发现，血清LINC00993对食管癌的诊断具有重要价值，该部分结果与前期研究基本相符[7-8]。此外，本研究还发现，血清LINC00993水平在中晚期食管癌、食管腺鳞癌与低分化食管癌患者中的升高最为显著，提示三者与食管癌的不良预后密切相关。最后，本研究组进行了指标的预后评估，发现I-II期和III-IV期食管癌中高LINC00993组患者的生存时间显著短于低LINC00993组患者，提示食管癌患者血清LINC00993水平在评估患者预后中具有潜在价值，这些研究结果与LINC00993在乳腺癌患者中的机制研究结果相符，提示高表达的LINC00993在提示肿瘤患者预后不良中有一定价值。

近年来国内外多个研究报道指出血清MMP-2在重塑肿瘤微环境、促进肿瘤远处转移、以及在肿瘤诊断及预后等评价中具有积极的价值[10-11]。早前的研究已显示，胃癌患者血浆MMP-2基因表达水平较健康人显著上调，并认为MMP-2的上调参与到胃癌细胞的远处转移[12]。在乳腺癌研究中，Chien等[13]发现癌组织中MMP-2基因表达显著高于癌旁组织，并指出MMP-2的表达参与肿瘤相关巨噬细胞的活化，是构成肿瘤微环境的重要因素。本次研究，我们首次通过临床大样本检测食管癌患者血清中MMP-2的差异表达，并发现血清MMP-2水平在中晚期食管癌、食管腺鳞癌与低分化食管癌患者中的升高最为显著，与前期的相关研究相互呼应[12-13]。生存分析发现，I-II期和III-IV期食管癌中高MMP-2组患者的生存时间均显著短于低MMP-2组患者，提示食管癌患者血清MMP-2水平在评估患者预后中具有潜在价值。

ROC曲线分析显示，血清LNC00993、MMP-2和CEA在区分食管癌与对照组时具有一定的价值，当联合LNC00993、MMP-2和CEA等指标时在区分食管癌与对照组时的灵敏度达到92.7%，提示联合上述三种血清标志物具有较高的临床应用价值。然而，本次研究仍有如下不足：(1)本研究纳入120例食管癌患者，纳入的例数仍然是有限的，后期需要更大样本量的研究来证实LNC00993、MMP-2和CEA在我国食管癌患者中的临床价值；(2)本次研究中采用的LNC00993、MMP-2和CEA多个指标的联合模型虽然较各单独指标有较高的临床价值，但该模型的应用仍有待进一步的验证。

综上所述，本次研究发现了LNC00993、MMP-2和CEA对食管癌的潜在诊断价值，并证实LNC00993与MMP-2对食管癌患者的预后评估具有重要意义，这些发现有望为食管癌的临床诊疗提供新的途径。