痛风与MUTYH基因rs10527342位点多态性相关性探讨

蔡燕，邢苓玲，青鑫，何城，彭乙华

(川北医学院附属医院，1.检验科；2.内分泌科；川北医学院，3.检验系；4.转化研究中心，四川 南充 637000)

痛风是一种临床上以高尿酸血症以及发作性关节炎、关节变形、肾脏损害、痛风结节等为主要表现的疾病，常常伴发多种疾病，如糖尿病、心肌梗塞、肥胖、脑卒中等[1]，严重危害患者身体健康。近年来随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，原发性痛风患病率逐渐升高[2]，故有必要探讨痛风的发病原因，为早期诊断和治疗痛风奠定实验室基础。研究表明，原发性痛风与体内尿酸盐在组织和器官中的沉积有关，高浓度的尿酸盐可激活体内的NADPH氧化酶，使活性氧(ROS)生成增加，机体氧化/抗氧化系统失衡引起DNA损伤[3]。DNA糖基化酶MUTYH基因与DNA氧化损伤修复有关，AluYb8MUTYH变异是AluYb8插入到DNA糖基化酶MUTYH基因的第15个内含子中，可导致MUTYH基因功能异常，从而直接或间接引起疾病发生[4]。故本研究拟探讨MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性与我国汉族人群原发性痛风发病风险的相关性，为痛风的早期诊断筛选合适的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2014年至2016年在川北医学院附属医院风湿血液科就诊的183例原发性痛风患者作为研究对象[痛风组年龄(55.37±12.87)岁]，同期健康体检者213名作为对照组年龄(53.90±9.14)岁，均收集外周血、临床和实验室资料，提取基因组DNA备用。其中痛风组均符合1977年美国风湿病协会制定的痛风性关节炎诊断标准。对照组排除痛风、高尿酸血症、高脂血症、高血压、冠状动脉硬化性心脏病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病。所有纳入对象均知情同意。

1.1.2 试剂和仪器 外周血基因组DNA提取试剂盒、2×mastermix、琼脂糖均购自北京天根生化科技有限公司。PCR仪、凝胶成像仪为美国BioRad生产。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 选取文献[4]中报道的引物序列，并在Pubmed上进行在线比对，理论上无非特异性扩增，合成引物对用于后续实验。引物由北京博迈德生物有限公司合成，序列如下：正向引物 5′-TCTTGACCTGGAGACCTTCC-3′，反向引物 5′-AGCTGCTTCCTCCAAACAGC-3′。

1.2.2 外周血基因组DNA提取 所有患者及对照组人群均抽取EDTA抗凝外周静脉全血2 mL。按外周血基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因DNA，分装后置-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR反应 PCR反应体系为25 μL，包括2×mastermix 12.5 μL、10 μmol/L的正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、2 μL样品DNA、9.5 μL去离子水，置PCR反应管中。反应条件，95 ℃预变性5 min，循环反应：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。将扩增产物置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 电泳检测 对所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析：取8 μL PCR产物与1.5 μL的6× loading bufer混合，1%琼脂糖电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压110 V，电泳时间30 min；凝胶成像仪观察结果并拍照，记录并分析相关基因型。

1.2.5 相关生化指标检测 利用全自动生化分析仪，对所选样本的血糖(serum glucose,GLU)、甘油三脂(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、尿酸(serum uric acid,UA)尿酸等相关指标进行检测，记录结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS16．0数据分析软件对获得的数据进行处理，其中计数资料用卡方检验、计量资料采用t检验进行分析(以P<0.05表示差异有统计学意义)，各基因型及等位基因的相对危险度(odd ratio，OR)值和95%的可信区间(CI)经性别、年龄、GLU、TG、TC、UA等因素通过非条件Logistic回归校正。

2 结果

2.1 临床资料结果分析

痛风组和对照组间年龄、性别构成和TG差异无显著性(P>0.05)；但两组间UA浓度、GLU和TC之间差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 临床资料与痛风发病风险之间的关系

2.2 AluYb8MUTYH基因插入/缺失多态性PCR扩增结果

MUTYH基因intron15插入/缺失多态性可呈现2种不同的片段，长片段为：826 bp，含AluYb8插入序列；短片段为500 bp，不含AluYb8插入序列。人群中存在3种基因型，分别为纯合插入型(AluYb8 presence/presence,P/P)、纯合野生型(AluYb8 absence/absence,A/A)和杂合型(AluYb8 presence/absence,P/A)。MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性在痛风组中有167例(91.26%)、对照组中有209例(98.12%)得到有效扩增。见图1。

2.3 AluYb8MUTYH基因插入/缺失多态性与痛风发病风险相关性

痛风组中A/A、A/P、P/P基因型频率分别为36.53%、49.70%和13.77%，对照组中A/A、A/P、P/P基因型频率分别为24.88%、51.67%和23.45%。对照组中各基因型的分布符合Hardy-weinberg平衡(χ2=0.237，P=0.626)；痛风组各基因型与对照组进行比较，差异有统计学意义(χ2=8.792，P=0.012)，痛风组等位基因频率与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=8.540，P=0.003)，其中A等位基因与痛风发病风险有关[OR=1.544，95% CI(1.153～2.088)]。见表2。

表2 MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性在痛风患者中的分布[n(%)]

等位基因/基因型痛风组(n=167)对照组(n=209)χ2值P值OR (95%CI)基因型8.7920.012A/A61(36.53)52(24.88)A/P83(49.70)108(51.67)P/P23(13.77)49(23.45)等位基因8.5400.0031.544(1.153～2.088)A205(61.38)212(50.72)P129(38.62)206(49.28)

3 讨论

原发性痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，其发病与体内尿酸盐在组织和器官中的沉积有关，高浓度的尿酸盐可激活体内的NADPH氧化酶，使活性氧(ROS)生成增加，机体氧化/抗氧化系统失衡，体内超氧化物歧化酶(SOD)合成减少，抗氧化能力降低[5]，导致机体发生氧化损伤，如DNA损伤。DNA糖基化酶MUTYH基因定位于染色体1p32.1至p34.3，含有16个外显子，MUTYH基因编码是一种特异的腺嘌呤转葡糖基酶，在复制后切除子链DNA中与母链8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)错配的A。MUTYH基因AluYb8MUTYH插入/缺失基因多态性可引起低效的DNA修复和外周循环中炎症因子IL-1水平的增加，与衰老[6]、糖尿病[7]、胃癌[8]等高度相关。故本研究拟探讨DNA酶修复基因MUTYH基因AluYb8MUTYH变异与痛风发病的关系。

实验结果显示MUTYH基因AluYb8MUTYH在汉族人群中呈多态性分布，痛风组中有167例(91.26%)、对照组中有209例(98.12%)得到有效扩增，阴性标本可能与DNA提取不佳有关；对照组中MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性基因型分布符合Hardy-Wernberg平衡(χ2=0.237，P=0.626)；其中痛风组中A/A、A/P、P/P基因型频率分别为36.53%、49.70%和13.77%，对照组中A/A、A/P、P/P基因型频率分别为24.88%、51.67%和23.45%；痛风组各基因型与对照组进行比较，差异有统计学意义(χ2=8.792，P=0.012)，痛风组等位基因频率与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=8.540，P=0.003)，其中A等位基因在痛风组中比例较高[OR=1.544，95%CI(1.153～2.088)]，提示A等位基因与痛风发病风险密切相关。

氧化应激(oxidative stress,OS)指体内遭受有害刺激时体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基等产生过多，氧化和抗氧化系统失衡，导致脂类、蛋白质和核酸等结构和功能改变，从而引起DNA链断裂、DNA位点突变等DNA损伤[9]。本研究还发现痛风组的TC、GLU明显高于对照组，提示痛风患者体内存在血脂和血糖紊乱，王雪娇等[10]研究结果显示原发性痛风患者存在脂质代谢紊乱，N-HDL-C、TC、TG和LDL均比对照组明显增加，而HDL明显降低。过氧化的脂质在生物体内积聚，可以破坏细胞的结构和正常生理功能，对生物体最大的损害就是引发DNA损伤，当DNA损伤发生后，机体可开启修复功能，通过光修复、切除修复、重组修复、SOS修复等方式对损伤进行修复[11]。如果修复成功，DNA结构可能恢复而重新执行其功能；当修复失败，发生DNA损伤的细胞可能发生死亡或基因突变，使得细胞获得新的功能或进化。

虽然其它研究表明MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性中P等位基因与衰老、糖尿病和肿瘤等有关，但本实验结果显示痛风患者的MUTYH基因AluYb8MUTYH多态性中P等位基因频率(38.62%)低于对照组(49.28%)，提示痛风患者体内虽然存在DNA损伤，但其急性发作可能与之关系不大；而A等位基因的频率(61.38%)高于对照组(50.72%)，研究[12]显示痛风的急性发作与淋巴细胞、单核-巨噬细胞等炎性细胞分泌IL-6、TNF-a等有关，分析可能携带A等位基因的痛风患者的DNA损伤修复能力较强，使炎性细胞功能恢复，分泌炎性细胞因子，参与痛风性炎症的发生发展，引起痛风急性发作。