质膜型唾液酸酶对前列腺癌荷瘤小鼠恶病质影响的研究

李晓洁，姜俊，周瑞芳，刁爱芹，郑涛，叶军

(1.泰州职业技术学院医学技术学院基础与药学教研室；2.泰州市人民医院中心实验室，江苏 泰州 225300)

短期内患者体重快速下降是多种肿瘤共同的临床表现之一，患者体重下降的可能原因是肿瘤细胞快速生长时需摄取体内大量营养物质，为其生理活动提供能量。研究发现肿瘤细胞主要通过糖酵解的方式供能，产热量低，摄食供能低于机体所需热量，导致机体正常细胞能量不足[1]，必须通过消耗自身组织以满足生命活动能量需求。若3个月来渐进性消瘦，体重比原始体重(诊断时)下降≥7.5%，或IBM指标<80%即诊断为恶病质[2]。Solheim等[3]认为恶病质的异常代谢，引起免疫力下降，可能刺激肿瘤细胞的生长和增殖。因此预防和延缓恶病质的发生对肿瘤治疗有重要意义。恶病质的发生机制目前尚不清楚。

唾液酸酶主要参与调解机体内唾液酸的含量[4-5]，目前根据反应底物和亚细胞定位分为四型[6-8]，其中第三型主要定位在质膜[9]，因此命名为质膜型唾液酸酶(human plasma membrane-associated sialidase，Neu3)。Neu3在多种肿瘤组织中高表达，如前列腺癌[10]、结肠癌[11]、卵巢癌[12]、神经胶质细胞瘤[13]等。

本研究建立前列腺癌原位肿瘤模型，观察Neu3不同表达水平干预措施后，裸鼠摄食量、体重等的变化，通过体外实验观察Neu3不同表达水平对细胞活性、迁移能力的影响，探寻Neu3影响恶病质的可能机制，研究成果有助于寻找延缓恶病质发生、发展，改善患者生存质量，延长生存期的药物。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

移液器(JILSON公司)、低温高速离心机、-80 ℃低温冰箱、自动高压蒸汽消毒器(SONY公司)、CO2恒温培养箱(SANYO公司)、电转仪、YZ-875超净工作台、无菌动物饲养隔离器、电子天平。

1.2 主要试剂

IMDM培养基、胰蛋白酶(GBICO 美国)、胎牛血清(Hyclone公司)、MTT(SIGMA 美国)LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)试剂盒。

1.3 质粒、菌种及细胞系

PC-3、LNCaP细胞均购于美国标准菌库，质粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP购于上海吉凯化学公司，pGCsi-Neu3质粒为作者研究生期间在吉林大学病理学与病理生理学实验室构建，干预效率大于50%，减毒沙门氏菌为吉林大学病理生理学实验室所保存。

1.4 细胞培养及转染实验

PC-3、LNCaP细胞按ATCC培养条件：用含有100 μg/mL青链霉素IMDM(Hyclone,USA) 、10%胎牛血清的培养液在37 ℃含5% CO2孵育箱中常规培养前列腺癌PC-3细胞并传代。转染操作参照Lip2000说明，只加入转染试剂实验分组命名为Mock，转染阴性质粒pGCsi-Scramble的实验分组命名为pGCsi-Scramble，转染pGCsi-Neu3质粒实验分组命名为pGCsi-Neu3，Mock和pGCsi-Scramble统称为对照组。

1.5 MTT实验

取对数生长期的PC-3、LNCaP细胞，按照转染实验分组，每组设有5个重复孔，MTT法测定各孔的OD值，间接衡量细胞增殖能力。

1.6 减毒沙门氏菌感受态电转导入目的基因及干涉效率检测

在预冷后的电转杯中加入1 μL质粒和100 μL减毒沙门氏菌，在参数为：电压600 V，单次电击，电击持续时间30 ms的条件下进行目的基因导入操作。混合物滴于含Amp的LB平板 37 ℃培养16～20 h。选取单菌落，转移至LB液体培养基培养，待OD600大约为0.4时保存菌液，并将其中一部分并送上海吉凯化学公司测序，检测是否构建成功。通过RT-PCR和Western Blotting两种方法检测在体内是否可发挥体外类似的沉默效率。

1.7 人前列腺癌裸鼠肿瘤原位模型的建立及处理

将购置的6周左右BALB/C nu/nu雄性裸鼠饲养于大型恒温无菌硬塑隔离器。按照每只小鼠注射100 μL细胞悬液，细胞悬液浓度为2.0×107/mL的参数进行肿瘤皮下模型的制备。当皮下肿瘤生长至最大直径为0.5 cm时，在无菌环境中分离皮下肿瘤，并割成2×2×2 mm3大小的瘤块，为后续肿瘤原位模型做准备[10]。将肿瘤原位模型术后状态良好的小鼠随机分组，每组6只。对照组(Mock)给予PBS，Attenuated Salmonella组(AS)给予减毒沙门氏菌，pGCsi-Scramble质粒组(pGCsi-Scramble)给予携带pGCsi-Scramble质粒的减毒沙门氏菌，pGCsi-Neu3质粒组(pGCsi-Neu3)携带pGCsi-Neu3质粒的减毒沙门氏菌。通过尾静脉给药的方式进行给药。每两周给予一次，共给两次。在4、8、12、16等4的倍数的时间点检测裸鼠的进食量、体重。每组老鼠的进食量=(初始投放食物量-检测时间点实际食物量)/(天数)。

1.8 ELASA 法测定裸鼠血清IL-6的水平

选用IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)试剂盒，测定过程参照试剂说明书完成。

1.9 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件包处理，应用Excel作图。用F检验首先进行方差分析，以q检验判断差异显著性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察pGCsi-Neu3质粒对肿瘤细胞形态的影响

PC-3细胞转染pGCsi-Neu3质粒24 h后，细胞透光性降低，细胞变圆，伪足减少，产生大量漂浮细胞，对照组细胞呈现梭型，透亮度好，少见漂浮细胞，见图1A。LNCaP细胞转染pGCsi-Neu3细胞发生与PC-3细胞类似的形态学变化，见图1B。

2.2 MTT检测肿瘤细胞转染后细胞增殖变化

PC-3细胞转染pGCsi-Neu3质粒后，在24 h、48 h、72 h等时间点检测细胞数目，其结果显示转染pGCsi-Neu3质粒后细胞数目增长速度明显减慢，与对照组相比有统计学意义(P<0.01)，见图2A。LNCaP细胞转染pGCsi-Neu3质粒后获得与PC-3细胞类似的趋势，见图2B。

2.3 划痕实验检测细胞转染pGCsi-Neu3质粒细胞迁移能力的改变

转染后分别在0 h、12 h、24 h拍照并测量划痕宽度，结果显示转染12 h后，对照组(Mock)以及转染空质粒组(pGCsi-Scramble)细胞出现明显迁移，转染24 h后，转染pGCsi-Neu3质粒组细胞迁移的距离与对照组(Mock)以及转染空质粒组(pGCsi-Scramble)细胞迁移距离与相比差异明显减小，有统计学意义(P<0.01)。

2.4 裸鼠进食量的检测

裸鼠进食量数据显示Mock组以及AS组和pGCsi-Scramble组，裸鼠进食量逐渐减少，试验结束时，与pGCsi-Neu3实验组相比进食量差异明显(P<0.05，P<0.01)。见图4。

2.5 裸鼠体重的检测

裸鼠体重数据显示Mock组以及AS组和pGCsi-Scramble组裸鼠体重逐渐减轻。第20天起与pGCsi-Neu3实验组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；试验结束时，与pGCsi-Neu3实验组相比体重差异明显(P<0.01)，见图5。

2.6 裸鼠肿瘤组织Neu的表达

取不同分组的肿瘤组织，通过RT-PCR和Western Blotting 检测通过减毒沙门氏菌运载后，在体内Neu3在RNA和蛋白水平的沉默效率。见图6。

2.7 裸鼠血清IL-6的检测结果

裸鼠血清IL-6检测结果显示：Mock组以及AS组和pGCsi-Scramble组IL-6水平分别为(121.76±34.25)pg/mL，(118.76±30.89)pg/mL，(116.76±32.46)pg/mL。pGCsi-Neu3组IL-6水平为(60.76±20.88)pg/mL，与Mock组以及AS组和pGCsi-Scramble组相比IL-6水平明显下降。

3 讨论

恶病质主要表现为患者食欲差，进食量下降，体重非意愿性逐渐下降，外形呈现皮包骨头。肿瘤末期大约有80%的病人会发生恶病质[14-15]。很多肿瘤患者并非死于肿瘤本身，而是死于恶病质[16-17]。研究数据表明：肿瘤患者体重下降30%，肌肉蛋白储备下降75%，是预示生存率降低的独立危险因素[18]。由于肿瘤细胞进行糖酵解进行供能，产热量低，可能导致机体所需进食量与患者实际进食量差值变大，因此机体需要分解自身成分用于供能。本实验下调Neu3表达，通过光镜观察到细胞透亮度降低，伪足数量减少。通过MTT实验发现当Neu3表达水平下降时细胞增殖能力下降；划痕实验证实细胞迁移能力下降。利用减速沙门氏菌作为运载体进行靶向治疗。前列腺癌荷瘤小鼠Mock组、AS组和pGCsi-Scramble组小鼠在实验过程中，体重不断下降，摄食量减少，精神状态较差，活动较少，逐步出现恶病质征象，在实验结束时脂肪层较薄，皮肤苍白，背部可清晰的看到脊柱棘突。pGCsi-Neu3实验组体重较对照组相比，精神状态尚好，脂肪层相对正常，皮肤较红润，恶病质征象不明显。IL-6作为炎性刺激因子，在多种肿瘤中高表达，与恶病质、晚期肿瘤阶段和存活率相关[19-20]。本研究下调Neu3，IL-6表达下降。根据以上结果推测，恶病质的发生可能与肿瘤细胞的数目相关。肿瘤细胞绝对数越大，摄食供能低于机体所需热量差值越大。肿瘤细胞分布越广，越容易从周围细胞获取能量。肿瘤的分布主要通过转移实现。肿瘤细胞转移早期形成各种伪足，其中侵袭性伪足关注度最高[21]。细胞伪足是肿瘤转移的重要工具，其运动是一个主动耗能过程[22]。因此，下调Neu3延缓前列腺癌荷瘤小鼠恶病质发病时间和疾病发生进展，其可能机制时抑制肿瘤细胞增殖和细胞迁移能力及IL-6的水平实现的。

总之，本研究表明Neu3可改善裸鼠的食欲，延缓恶病质的发生，其具体分子机制将在下一步深入探讨。