宣威女性肺腺癌及脑转移瘤组织中Notch1的表达及临床意义研究

牛华涛，白鹏，左频，袁红平，陈颖，黄云超

(1.昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院神经外科，云南省肺癌研究重点实验室，云南 昆明 650118；2.昆明医科大学第一附属医院微创神经外科，云南 昆明 650032；3.昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院胸外科，云南省肺癌研究重点实验室，云南 昆明 650118)

作为新发病例数量和死亡率都居体内各种肿瘤第一位的肺癌[1-2]，愈后差，且近年来发病率仍有不断上升趋势[3]。肺癌易发生远处转移，而脑是其常见的转移器官之一[4]。肺癌患者发生脑转移的概率高约23%至65%，属于颅内各种转移瘤最常见的原发肿瘤类型[1]。据统计，肺癌导致的脑转移瘤病例超过脑内原发性肿瘤的10倍，已经在脑内各种恶性肿瘤中排名第一[5]。

肺癌脑转移患者仅有约1个月的自然中位生存期，而即使经过治疗后的此类患者，中位生存时间也仅可延长到3.1～12个月[6]。因此，对于肺癌发生脑转移的患者而言，如何有效延长生存期具有重大的现实意义，进一步研究肺癌如何发生脑转移的机制已经受到更多的关注。

中国云南宣威地区的女性肺癌是全球肺癌发病率及死亡率均为最高的非吸烟女性肺癌[7]，细胞类型以腺癌为主，具有发病年龄提前、放化疗不敏感的特征。科题组之前已经进行了相关研究，结果显示，Notch信号通路与宣威女性肺腺癌的发生发展密切相关，Notch1在宣威女性肺癌中呈高表达，表现为促癌作用[8-9]，而在进一步的更加深入研究过程中，目前Notch1在肺癌脑转移瘤中的表达及相关性研究尚不清楚，值得深入研究。

课题组假设Notch1可能在宣威女性肺腺癌患者发生脑转移的过程中起到部分作用，拟通过对宣威女性肺腺癌原发灶和脑转移灶中的Notch1表达差异进行初步研究，初步了解其在肺癌发生脑转移过程中的部分作用，为后续更加深入的研究奠定部分基础。

1 资料和方法

1.1 临床研究资料

纳入标准：(1)各项临床资料完整无缺失；(2)在宣威地区出生并生活居住超过3代；(3)女性原发性肺腺癌患者；(4)无吸烟史。排除标准：(1)曾行放、化疗；(2)患有其他类型肿瘤。

1.2 资料来源

20位患者来源于2003年1月至2013年12月在云南省肿瘤医院和昆明医科大学第一附属医院先后行肺癌及脑转移瘤的切除手术，术后均行病理学检测，而且病理学检测结果均为腺癌。年龄方面：其中14例患者超过55岁，6例患者<55岁；病理方面：高分化腺癌1例，中分化腺癌4例，低分化腺癌15例；肺癌原发灶方面：最大直径≤3 cm者7例，最大直径﹥3 cm者13例；脑转移瘤方面：肿瘤最大直径≤3 cm者5例，肿瘤最大直径﹥3 cm者15例。各有20例的原发灶及脑转移灶组织标本，切除后的肿瘤标本均于1 h内放置于4%多聚甲醛中固定备用。样本采集均得到患者及家属的同意，并事先报备并取得云南省肿瘤医院和昆明医科大学第一附属医院伦理委员会同意。

1.3 方法

免疫组织化学染色：常规石蜡包埋，连续切片，制备病理切片，采用免疫组织化学SP法。步骤按试剂盒说明书操作。Notch1一抗为兔抗人多克隆抗体(美国Millipore公司，1∶100)，阴性对照为PBS代替一抗。按半定量积分法判定蛋白表达结果，见表1。

表1 按半定量积分法判定蛋白表达结果

*阴性、弱阳性表达归类为低表达；中等、强阳性表达归类为高表达。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，P<0.05为统计学意义差异。肺癌原发灶及脑转移灶间的Notch1蛋白的表达关系采用χ2检验。

2 结果

Notch1蛋白的阳性染色呈棕黄色颗粒，细胞质为主要定位区域，在宣威女性肺腺癌原发灶组织中呈65%的阳性表达率；而在脑转移灶中呈85%的阳性表达率，两者差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2及表2。

表2 Notch1在宣威女性肺腺癌原发灶及脑转移灶组织中的表达

标本Notch1蛋白表达阳性阴性χ2值P值原发灶137脑转移灶17311.60.009

3 讨论

统计资料表明，脑内各种转移瘤的数量已经超过原发性颅内肿瘤的10倍，上升为脑内所有恶性肿瘤的首位[5]。对于肺癌患者而言，最终大约有23%～65%的患者最终会发生颅内转移。

肺癌的发病率一般有如下表现：男性患者超过女性患者，城市患者高于农村患者，而且来自发达地区的患者高于来自落后地区的患者。而来自云南省宣威地区的肺癌患者发病率却与其他地方表现不一致，有着自己的独特特征：农村患者高于城市患者、女性患者所占比明显高于其他地区[3]。

中国云南宣威地区的女性肺癌是全球范围内发病率及死亡率都为最高的非吸烟女性肺癌[7]，细胞类型以腺癌为主。以前将宣威女性肺癌的主要致病因素归为室内烧煤污染。可是，经过当地的改炉改灶工作后，调查发现：源自宣威地区的肺癌患者(尤其是女性肺癌患者)死亡率并未得到下降；相反，仍有上升[7]。鉴于此结果，对于宣威女性肺癌的高发致病因素而言，除去外在的环境因素，机体内在的遗传基因因素亦逐渐受到更多的重视和关注。

肺癌若进展到脑转移阶段，预后极差。据统计，此类患者若脱离治疗，其仅有约1个月的中位生存时间；而即使是经过各种放化疗、靶向治疗等各种治疗后，肺癌脑转移的患者也仅有3.1～12个月的中位生存时间[6]。

因此，如何有效降低肺癌发生脑转移的概率、尽量延长此类患者的生存时间具有重要的临床和现实意义，需要进一步深入了解肺癌如何发生脑转移的具体机制。

近些年来，由于Notch信号通路在多种肿瘤发生发展中的重要作用，而逐渐受到更多的关注，成为研究热点。Notch基因可根据肿瘤细胞类型的不同和生长环境的差异而扮演不同甚至相反的角色[10-13]，可能起到抑癌或促癌的角色。

为了探讨Notch1在宣威女性肺腺癌发生脑转移过程中的角色和作用，本课题组之前已经进行了相关研究，结果显示，Notch1在宣威女性肺癌中呈高表达，表现为促癌作用[8-9]，初步确定了研究的意义和可行性。

基因在转录为有功能的蛋白质的过程中，需要经过许多步骤的不同修饰，因此，在本次研究中，为了能更准确的确定Notch1基因在肺癌发生脑转移过程中的作用，本研究以Notch1蛋白表达来进行研究分析。而且由于在前期在多种肿瘤的研究中Notch1都有异常表达，但结果不够统一，缺乏经典的阳性对照物。因此，课题组在前期实验准备中，历经多次反复尝试，对抗体浓度、洗涤的要求(例如时间及次数)等进行了进一步优化，结果获得了可靠的结果，因此，本研究未再选用其他阳性对照物。

本次实验结果如下：在宣威女性肺腺癌原发灶和转移灶中分别呈65%和85%的阳性表达率，两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结果说明，在宣威女性肺腺癌发生脑转移的过程中，Notch1可能起到部分促癌作用，但具体的相关机制有待进一步深入研究。

综上，本研究揭示了Notch1与宣威女性肺腺癌发生脑转移有关，可作为宣威女性肺腺癌及其脑转移瘤的一个潜在治疗靶点，为宣威女性肺腺癌及其脑转移瘤的治疗提供部分实验依据及可行方向。