hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

许媛，赵明才

(1.川北医学院附属医院检验科；2.川北医学院医学检验系；3.川北医学院转化医学研究中心，四川 南充 637000；4.遂宁市中心医院检验科，四川 遂宁 629000)

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤，每年全球约有100万人患HCC[1-2]，其中约50%发生在中国[3-4]。肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是肿瘤坏死因子配体超家族的成员之一。TWEAK由249个氨基酸组成，经蛋白酶处理后成为含156个氨基酸的可溶性细胞因子，与细胞肿瘤坏死因子受体超家族成员Fn14结合发挥生物学效应。TWEAK/Fn14信号通路在调节肿瘤细胞细胞增殖、存活、侵袭及血管生成等生物学过程中具有重要的作用[5-6]。因此，调节TWEAK表达可能成为肿瘤治疗的新策略。本研究通过分子克隆技术构建携带TWEAK基因的慢病毒载体，并通过PCR、间接免疫荧光和Western Blot技术对TWEAK进行表达分析，为探讨TWEAK在肝癌发生发展中的生物学功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人胚肾细胞293T(购自美国ATCC)，人肝癌细胞系HepG2(川北医学院转化医学研究中心保存)。

1.2 载体及主要试剂

慢病毒包装质粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)及慢病毒载体质粒(Plentilox3.7)均由川北医学院转化医学研究中心郭晓兰教授惠赠；大肠杆菌DH5α由川北医学院转化医学研究中心保存；基础培养基DMEM购自Hyclone公司、胎牛血清FBS和胰酶(0.25%，含EDTA)购自Gibco公司、青霉素(10 000 U/mL)和链霉素(10 000 μg/mL)购自华北制药公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Gibco公司；qRT-PCR mix 购自TaKaRa公司；限制性内切酶(NheⅠ和BsrGⅠ)、T4 DNA连接酶、DNA maker购自Fermentas公司； Lipofectamine TM 2000、Trizol 购自美国Invitrogen公司；酵母提取物及胰蛋白胨购自Oxioid公司。

1.3 TWEAK基因扩增

PCR扩增人TWEAK基因序列：根据TWEAK基因CDS区(GenBank:AF030099.1，GI:2707219，1 306 bp)及酶切位点设计引物(表1)，以质粒pORF5-hTWEAK为模板进行扩增。反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，62 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35 cycles；72 ℃ 10 min。扩增完成后采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

表1 人TWEAK基因扩增引物序列

1.4 Plentilox3.7-TWEAK重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

将扩增的hTWEAK基因片段及载体质粒Plentilox3.7在37 ℃条件下用限制性内切酶NheⅠ和BsrGⅠ进行双酶切，2 h后，1.0%琼脂糖凝胶电泳。切下含目的片段的凝胶，按照胶回收试剂盒提供的方法回收目的片段。在T4 DNA连接酶作用下将目的基因连接至Plentilox3.7载体中。将连接产物转化入感受态细胞DH5α并进行培养和筛选，挑取单个菌落、增菌、提取质粒，将提好的质粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶进行双酶切并通过PCR进行鉴定。取测序正确的克隆进行增菌，用除内毒素大提试剂盒大量提取阳性重组质粒。

1.5 慢病毒包装

复苏293T细胞，传代培养。消化对数生长期的细胞，计数，按5×106/盘的量接种于10 cm细胞培养皿中，在37 ℃、5% CO2培养箱内培养细胞至70%～80%融合度时更换无血清培养基，继续培养2 h后进行脂质体转染。利用脂质体Lipofectamin2000TM将含hTWEAK的质粒和包装质粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)共转染293T细胞(包装含hTWEAK基因的病毒，实验组)，同时将不含hTWEAK的质粒和上述三种包装质粒共转染293T细胞(包装不含hTWEAK基因的病毒，对照组)。在37 ℃、5% CO2培养箱内培养6 h后更换为完全培养基，72 h后收集培养上清液即为过表达hTWEAK的病毒液以及无hTWEAK的阴性对照病毒液。将收集的上清液在4 ℃、3 000 g离心力条件下离心10 min后收集上清液。用0.45 μm滤器过滤离心后的上清，无菌分装后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.6 重组病毒感染目的细胞

将对数生长期的HepG2细胞铺入24孔板中，培养过夜，使细胞融合度达到50%左右。从-80 ℃冰箱取出病毒液冰上融化，分别按照1∶10和1∶100的比例配制病毒悬液和完全培养基的混合液，加入10 μg/mL的Polybrene以提高感染率，同时设置阴性对照组。在37 ℃、5% CO2条件下继续培养48 h后，更换新鲜培养基继续培养至72 h。

1.7 qRT-PCR检测HepG2细胞中TWEAK基因相对表达量

从培养箱取出24孔板，收集上清后采用0.25%胰酶消化细胞，3 500 rpm/min离心5 min收集细胞，加入1 mLTrizol试剂混匀，按照说明书提取细胞总RNA，采用NanoDrop 2 000 c微量分光光度计测量RNA浓度。采用逆转录试剂盒以RNA为模板逆转录成cDNA后，采用SYBR Green染料法检测实验组和对照组中TWEAK mRNA相对表达量。

1.8 免疫荧光法检测HepG2细胞中TWEAK表达

取出24孔板，去上清后用PBS洗涤2次。采用多聚甲醛(4%)固定细胞15 min后，用TBST洗涤3次，再将含0.1% Triton X-100和5% BSA的封闭液加入培养皿中封闭，1 h后弃去封闭液，滴加1∶100稀释的兔抗人TWEAK工作液，4 ℃ 孵育过夜。弃去工作液后再用PBS洗涤3次，滴加1∶64稀释的FITC标记的山羊抗兔工作液，37 ℃孵育30 min。孵育结束后用PBS洗涤3次，滴加DAPI工作液(1∶1 000稀释)室温孵育5 min，PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。

1.9 Western Blot检测HepG2细胞中TWEAK表达

从培养箱取出24孔板，收集上清备用。收集细胞，在冰上裂解细胞30 min后 4 ℃离心收集蛋白。采用BCA法测量总蛋白浓度后，Western Blot检测HepG2细胞中TWEAK蛋白表达量。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 hTWEAK的PCR扩增产物

采用普通PCR技术从pORF5-TWEAK质粒中扩增TWEAK基因序列全长片段，其产物大小为750 bp。

2.2 重组质粒Plentilxo3.7-TWEAK鉴定

2.2.1 PCR及酶切鉴定 hTWEAK基因与载体质粒Plentilxo3.7重组，构建Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒。以Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒为模板，PCR扩增TWEAK基因片段，琼脂糖凝胶电泳后可见一条750 bp的特异性条带；对Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见一条750 bp条带和7 670 bp左右的条带(图1)。

2.2.2 测序鉴定 挑取含Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒的阳性克隆，扩大培养，提取质粒后送南京金斯瑞公司基因测序(图2)，将测序结果与NCBI-blast数据库进行比对分析，重组质粒碱基序列正确，无突变位点。

2.3 细胞转染结果

2.3.1 实时荧光定量PCR检测结果 如图3所示，Plentilxo3.7-TWEAK转染组TWEAK mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。

2.3.2 免疫荧光检测结果 免疫荧光检测TWEAK蛋白表达及定位，其中绿色荧光信号代表TWEAK蛋白。由此可见，Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒能在HepG2细胞中表达，且主要分布在胞浆中(图4)。

2.3.3 Western-blot检测结果 如图5所示，转染Plentilxo3.7-TWEAK重组质粒的HepG2细胞中，TWEAK蛋白表达水平明显高于对照组。

3 讨论

TWEAK基因作为肿瘤坏死因子配体超家族中的重要成员，在肝脏疾病发生发展中具有重要的作用。TWEAK能通过NF-κB介导的肌球蛋白轻链激活和破坏紧密连接的方式促进丙肝病毒进入肝细胞[7]，也能驱动肝祖细胞和肝星状细胞之间通过细胞因子和化学因子“交叉对话”而影响慢性肝损伤病理结果[8]。TWEAK也能促进肝癌细胞增殖，在肝癌细胞系SMMC7721中通过siRNA沉默TWEAK基因后，肝癌细胞的增殖和迁移能力均受到抑制[9]。TWAEK除具有促肿瘤效应外，它同时也具有抗肿瘤效应。TWAEK可通过JAK-STAT信号通路诱导大肠癌WiDr细胞产生β-干扰素，从而发挥抗肿瘤效应，γ-干扰素可增加TWAEK诱导的细胞死亡[10]。这些研究提示，TWEAK在肝脏疾病的发生和发展过程中具有重要的作用，调节TWEAK表达可望成为疾病治疗的重要途径。

肝细胞肝癌发病隐蔽，不易早期发现，因此传统的手术切除治疗、放射治疗和药物治疗是肝癌治疗的主要手段。随着分子生物学技术的发展，肿瘤基因治疗逐渐成为肿瘤最具前景的治疗方式之一。肿瘤基因治疗需要载体运送基因序列或基因干扰序列。慢病毒载体是基因治疗中常用的病毒载体。慢病毒载体是改造的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)载体，具有感染效率高、自身抗原性弱、表达稳定、操控性强、可容纳外源目的基因片段大、可感染分裂期和非分裂期细胞等优点，已经被广泛地应用于生命科学和医学研究。本研究成功构建了携带人TWEAK基因的慢病毒载体质粒，并能在293T细胞中成功包装出具有活性的慢病毒颗粒。将含有TWEAK基因的慢病毒颗粒感染HepG2细胞后，其TWEAK基因mRNA及蛋白表达水平明显高于不携带TWEAK基因的慢病毒感染的细胞。间接免疫荧光技术发现外源性TWEAK蛋白表达主要位于细胞质，证明TWEAK基因成功转入肝癌细胞中并合成了目的蛋白。这些结果提示，本研究所构建的携带TWEAK基因的慢病毒载体能在HepG2细胞中高效表达TWEAK，这为研究TWEAK对肝癌细胞生物学行为的影响及分子机制奠定了基础。