NLRP3、IL-1βmRNA表达水平与酒精性肝硬化发病相关性及作用机制分析

董德嘉 卢海波 吴伟 豆发福

流行病学研究证实，我国2010至2017年酒精性肝硬化(ALC)的平均发病率可达373～492万人左右[1-2]。探讨血清学指标能够在消化系统炎症性疾病的病情评估过程中发挥重要作用。炎性小体(NLRP3)的上升能够通过激活体内下游多种炎症信号通路促进、加剧炎性细胞对肝脏上皮组织的浸润，进而促进肝上皮细胞的凋亡和坏死[3]；白细胞介素(interleukin，IL-1β)的上升能够通过加剧体内急性炎性反应，进而影响到机体免疫损伤过程。本研究选取我院收治的酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)患者、ALC患者，探讨了相关指标的变化，现报道如下。

资料和方法

一、一般资料

选取我院2016年7月至2018年5月收治的AH患者74例、ALC患者30例，以及30 例由肝移植手术时获得的正常肝组织样本作为对照，所有样本均为男性，均留有血浆样本，进行相关生化指标的检测。AH组患者年龄为(42.68±5.31)岁，饮酒时间(17.00±3.25)年，日均饮酒量(150.00±30.25)g；ALC组患者年龄为(42.97±6.82)岁，饮酒时间(21.05±6.82)年，日均饮酒量(80.20±15.32)g。

二、纳入标准

参照中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2010年修订的《酒精性肝病诊疗指南》诊断入组；签署试验知情同意书。

三、排除标准

排除HBV、HCV和HIV感染、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、肝脏原发性或继发性恶性肿瘤、孕妇以及合并严重的心、脑、血管、呼吸系统、泌尿系统疾病者。

四、检测方法

采集入院后静脉血，离心后收集上清液，采用免疫发光法检测NLRP3水平，检测仪器为美国Bio-Bad全自动酶标仪，配套试剂盒购自罗氏检测公司；收集上清液后加入采用全自动生化法检测ALT、ALP、Alb、AST值，加入ALT、ALP、Alb、AST检测试剂盒，配套试剂盒购自南京碧云天生物检测公司，微型离心机HITETIC购自上海精密仪器有限公司。

采集患者的静脉血5 mL，加入0.2 mL的氯仿， 2～8 ℃ 冰冻离心机中离心 (12 000 g/min，15 min)，反复1次洗涤RNA，弃上清，在管底部可见一乳白色小沉淀物，加入 1 mL 75% 乙醇， 0.1% DEPC 水溶解。加入IL-1βmRNA基因和 GAPDH 上下游引物、 0.1% DEPC 使其终浓度均为 20 pmol/μL，制备反应体系，RT-PCR 扩增条件与参数：48 ℃ 45 min，94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 60 s，68 ℃ 2 min 共 40 个循环；循环完毕后 68 ℃ 延伸 7 min。

五、统计学方法

结 果

一、样本生化检测资料

对不同组患者的各项生化指标进行检测，结果见表1。

二、 不同组样本间NLRP3表达量的对比

对照组样本NLRP3表达量为(5.62±1.68) ng/mL，AH组样本NLRP3表达量为(26.58±2.69) ng/mL，ALC组样本NLRP3表达量为(31.35±5.58) ng/mL；对照组样本的NLRP3的表达量与AH组(t=2.0086，P=0.0000)，ALC组(t=2.0484，P=0.0000)均差异有显著统计学意义，AH组和ALC组的NLRP3表达量也差异有显著统计学意义(t=2.0086，P=0.0001)。对所有样本进行NLRP3表达量检测，结果见表2。

三、不同组样本间IL-1βmRNA表达量的对比

对照组样本IL-1βmRNA表达量为(0.15±0.02) ng/mL，AH组样本IL-1βmRNA表达量为(0.41±0.12) ng/mL，ALC组样本IL-1βmRNA表达量为(0.28±0.15) ng/mL；对照组样本IL-1βmRNA表达量与AH组(t=2.0085，P=0.0000)，ALC组(t=2.4258，P=0.0025)均差异有显著统计学意义，AH组和ALC组的IL-1βmRNA表达量也差异有显著统计学意义(t=2.0086，P=0.0018)。对所有样本进行NLRP3表达量检测，结果见表2。

四、 NLRP3、IL-1βmRNA表达量升高与部分肝功能改变的关系

对各样本的NLRP3、IL-1βmRNA的升高量和肝功能指标进行对比，AH组和ALC组样本血清中NLRP3和IL-1βmRNA的表达量均显著高于对照组样本，AH组的Alb指标稍有上升，ALC组的Alb水平显著上升；AH与ALC组的ALT与ALP水平增幅基本一致；AH组和ALC组的AST增幅均超过50%，且AH组的指标高于ALC组，结果差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同组患者的各项生化指标

注：*中性粒细胞/淋巴细胞比值

表2 NLRP3、IL-1βmRNA表达量升高与部分肝功能改变的关系

注：AH组与ALC组比较，*P<0.05,^P>0.05

讨 论

在乙型肝炎病毒感染病程较长的患者中，ALC或者AH的发生风险更高，远期多器官功能衰竭或者病死率可进一步上升[4-6]。 NLRP3作为炎性小体，其能够影响到体内的炎症信号通路的激活，导致下游IL-6或者IL-8等炎性因子的激活，促进肝脏间质细胞纤维化改变。NLRP3上升还能够促进中性粒细胞和巨噬细胞的富集，加剧了炎性细胞对于肝脏上皮细胞的吞噬和促凋亡作用[7-8]。NLRP3上升能够导致肝脏上皮细胞线粒体的损伤和线粒体膜完整性的破坏，加速肝功能的恶化[9]；IL-1βmRNA能够促进肝脏的炎性损伤，同时还能够调控树突状T淋巴细胞的功能，影响到CD4+淋巴细胞的功能活性。

在ALC或者AH组患者血清中，NLRP3、IL-1βmRNA的表达浓度均明显上升，提示NLRP3、IL-1βmRNA的高表达均可能影响ALC或者AH的病情进展。汪玉兰等[10]也通过探讨82例ALC患者的临床资料，发现在病例组患者血清中，NLRP3的表达浓度可平均上升35%以上。NLRP3在正常对照人群、AH及ALC患者中的表达浓度逐渐上升，趋势较为明显，提示NLRP3在不同阶段的肝脏病变过程中均具有持续性的促进作用。这主要是由于NLRP3上升能够诱导淀粉样蛋白β的激活，促进凋亡小体caspase-3的释放[1]。IL-1βmRNA虽然在ALC或者AH患者中均具有明显的上升表现，但相比于AH患者，IL-1βmRNA在ALC患者中的表达呈现下降的趋势。这考虑与IL-1βmRNA作为急性炎性因子，在AH这一合并有明显炎性肝脏损伤表现的患者中可以明显上升，而ALC患者其肝脏纤维化过程中，炎性反应程度有所下降，IL-1βmRNA可逐渐下降。在AH和ALC患者中，均存在明显的肝功能指标上升，同时NLRP3和IL-1βmRNA的表达量升高百分比均明显上升，进一步提示NLRP3、IL-1βmRNA与AH或者ALC的病情关系。