HBsAg阳性孕产妇IL28B基因多态性与HBV宫内感染发生风险关联性分析

李容 张杭 黄玺钥 杜丹

HBV感染婴幼儿可发展为HBV携带者且严重影响婴幼儿健康[1]。HBsAg及HBV DNA载量与新生儿宫内感染有关，降低HBV DNA载量或HBsAg水平可有效降低新生儿HBV感染率[2,3]。基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)与HCV感染等密切相关，同时还可参与机体多种疾病发生发展过程[4]。相关研究表明，白细胞介素28B(interleukin 28B，IL28B)可通过编码干扰素λ3进而促进HCV感染自发清除[5]。本研究通过分析HBsAg阳性孕产妇IL28B rs8099917 SNP与HBV宫内感染发生风险的相关性，为预防及阻断HBV宫内感染提供理论依据。

资料和方法

一、一般资料

选取2015年6月至2018年6月南方医科大学第五附属医院收治的2000例单胎足月HBsAg阳性孕产妇为研究对象，患者年龄20～32岁，平均(28.3±9.4)岁。根据是否发生HBV宫内感染将其分为感染组(658例)与未感染组(1342例)。HBV DNA载量≥1.0×103拷贝/mL[6]。另选取同时期正常分娩孕妇542例为对照组，年龄21～30岁，平均(27.6±9.2)岁。各组孕产妇年龄、孕周等临床资料比较均差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：孕产妇肝功能指标正常；初次妊娠；无黄疸者；临床资料完整者。排除标准：服用抗病毒药物；近期服用糖皮质激素类药物者；患有子痫前期及胎儿生长受限等并发症者；多胎妊娠；遗传性肝病；合并其他嗜肝病毒感染者。

二、主要试剂与仪器

血液基因组DNA提取试剂盒，购于天根生物科技有限公司；Nano Drop2000c核酸检测仪购于美国Thermo公司；TaqDNA Polymerase购自美国TaKaRa公司，ABI 377 DNA测序仪、PCR仪均购自美国ABI公司。电泳仪购于美国BIO-RAD公司，凝胶成像系统购自英国UVITEC公司。

三、HBsAg及HBV DNA载量检测

采用荧光定量PCR检测孕妇HBsAg及HBV DNA载量，试剂盒均购自艾康生物技术有限公司。

基因组DNA提取以及四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(amplification refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR) 应用DNA提取试剂盒提取全血DNA，检测其浓度与纯度，DNA样本稀释后，采用Sequenom软件对IL28B rs8099917所在DNA片段进行SNP基因分型，应用Primer软件设计IL28B rs8099917位点引物，PCR扩增、单碱基延伸引物均由美国Invitrogen公司合成；PCR反应体系共30 μL，PCR缓冲液(10×) 3 μL，位点rs8099917及T、G引物上下游各1 μL，dNTP Mix 2.4 μL，DNA样本8 μL,TaqDNA 0.3 μL，ddH2O 12.3 μL。反应程序设定：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μL，琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像系统观察结果。

IL28B rs8099917位点SNP基因型判定：野生型纯合子TT型，两条DNA条带，252 bp、182 bp；突变杂合子TG型，三条DNA条带，252 bp、182 bp、131 bp；突变纯合子GG型，两条DNA条带，252 bp、131 bp。

四、观察指标

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组受试者血清白细胞介素-17(IL-17)、IL-21、IL-4、转化生长因子-β1(TGF-β1)、γ干扰素(IFN-γ)水平，ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，酶标仪选购于美国BOI-RAD公司。

五、统计学方法

结 果

一、 IL28B rs8099917 SNP

IL28B rs8099917电泳结果见图1 。IL28B 在rs8099917存在单核苷酸多态性，分别为野生型纯合子TT型、突变杂合子TG型、突变纯合子GG型，测序验证准确率为100%。

图1 IL28B rs8099917琼脂糖凝胶电泳图

二、Hardy-Weinberg遗传平衡验证

感染组、未感染组及对照组IL28B基因型频率实际值与预测值对比，差异均无统计学意义(P>0.05)，IL28B基因型频率稳定，符合Hardy-weinberg平衡定律，见表1。

三、IL28B基因型频率对比

IL28B rs8099917位点基因型频率在感染组、未感染组及对照组间分布对比，差异有统计学意义(P<0.05)，且感染组G等位基因频率显著高于T等位基因频率(P<0.05)，而未感染组与对照组中G等位基因频率与T等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

四、IL28B SNP与血清指标表达的关系

观察并分析各组IL28B rs8099917基因位点TT、TG、GG基因型与HBV宫内感染有关的血清指标的关系，结果显示感染组TG与GG基因型患者血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平均显著高于TT基因型患者(P<0.05)，而IFN-γ水平显著降低(P<0.05)；

GG基因型患者血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平均显著高于TG基因型(P<0.05)，而IFN-γ水平显著低于TG基因型(P<0.05)。未感染组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 IL-6 rs1800796基因型频率实际值与预测值的比较

注：a为对照组比较；b为未感染组比较；c为感染组比较

五、 IL28B SNP与HBV宫内感染发生风险的相关性

采用logistic回归模型分析基因频率和基因型存在显著差异性的IL28B rs8099917位点突变基因型与HBV宫内感染发生风险的相关性，结果显示IL28B rs8099917 GG基因型为HBV宫内感染发生的危险因素，见表4。

表2 各组IL28B rs8099917基因型频率以及等位基因相比

表3 IL28B SNPs与血清指标表达的关系( ±s)

注：a为感染组比较；b为未感染组比较；c为对照组比较

表4 IL28B基因多态性与HBV宫内感染发生风险的Logistic分析

讨 论

母婴传播是HBV宫内感染的主要途径[7]，主要通过卵泡细胞将HBV传至胚胎进而导致新生儿乙型肝炎疫苗接种失败[8]。而孕产妇体内HBsAg阳性及HBV DNA载量过高均为HBV宫内感染的危险因素[9]。研究表明，SNP与宫颈HBV易感性密切相关，其突变基因纯合子可作为预测HBV感染的重要基因型[10]。本研究主要探讨HBsAg阳性孕产妇IL28B SNP与HBV宫内感染发生的相关性。

IL28B位于人19号染色体， IL28B多个SNP均与HCV感染及转归密切相关，但不同基因位点在HCV感染过程中表现不同[11]。IL28B rs8099917基因位点T等位基因可增加慢性乙型肝炎发展为肝硬化甚至肝癌的风险[12]。研究表明，IL28B rs8099917以TT基因型为主，而rs12979860以CC基因型为主，IL28B SNP可作为判断慢性丙型肝炎患者抗病毒疗效的重要指标[13]。IL28B rs8099917 SNP即TT型、TG型、GG型，感染组、未感染组及对照组IL28B基因型频率稳定，均符合Hardy-weinberg平衡定律。进一步分析各组IL28B rs8099917位点基因型分布，结果显示IL28B rs8099917位点基因型频率在感染组、未感染组及对照组间分布差异显著，其主要以TT基因型为主，与文献报道相似[14]。同时本研究发现，感染组IL28B rs8099917位点G等位基因频率显著高于T等位基因频率，而未感染组与对照组比较差异不显著，说明HBsAg阳性孕产妇IL28B rs8099917位点T等位基因突变为G等位基因与HBV宫内感染有关，分析原因可能为IL28B rs8099917 SNP可通过JAK-STAT信号转导途径，进而影响相关基因转录及翻译过程，最终引发病毒感染或发挥抗病毒清除作用[15]。提示IL28B rs8099917位点T→G导致HBV宫内感染率增加。

HBsAg阳性孕产妇发生HBV宫内感染后可引发免疫反应，CD4+T细胞会分化为辅助性T细胞(Th)Th1、Th2、Th17及调节性T细胞等，影响细胞平衡从而造成免疫系统紊乱，引起HBV宫内感染[16]。免疫失衡与IL-17及IL-21水平有关，Th17高表达可抑制调节性T细胞增殖，从而提高IL-17及IL-21水平导致免疫系统紊乱，并可引起HBV宫内感染[17]。研究发现，IL-4、TGF-β1、IFN-γ水平变化与Th1/Th2比例失衡有关，并可反映HBV宫内感染情况[18]。以上研究结果表明，血清IL-17、IL-21、IL-4、TGF-β1、IFN-γ水平与HBV宫内感染密切相关，本研究初步分析IL28B rs8099917 SNP与上述血清因子表达的相关性，结果显示仅HBV宫内感染组GG基因型孕妇血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平显著高于TG与TT基因型，而血清IFN-γ水平显著降低，提示IL28B rs8099917位点T→G突变可引起血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平变化，导致机体免疫系统紊乱，从而引发HBV宫内感染。同时本研究分析IL28B rs8099917 SNP与HBV宫内感染发生风险的相关性，Logistic分析显示突变基因型GG为HBsAg阳性孕产妇发生HBV宫内感染的危险因素。本研究结果揭示HBsAg阳性孕产妇IL28B rs8099917位点T→G基因突变可增加HBV宫内感染的发生。

综上所述，IL28B rs8099917 SNP对HBV宫内感染具有一定影响，G等位基因及GG基因型患者可增加HBV宫内感染发生风险，检测HBsAg阳性孕产妇IL28B基因型有助于预防HBV宫内感染发生。