一株高效解磷假单胞菌的分离鉴定及解磷特性

刘希旻，杨海霞，黄灵曦，李晓雁，权桂芝，杨红澎，黄海东,通信作者

一株高效解磷假单胞菌的分离鉴定及解磷特性

刘希旻1，杨海霞1，黄灵曦1，李晓雁2，权桂芝1，杨红澎1，黄海东1,通信作者

（1. 天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384；2. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300384）

磷是植物生长所必需的重要元素之一，土壤中的磷大都以难溶性磷的形式存在，难以被植物吸收利用。为提高盐碱地中磷的利用率，从天津滨海新区盐碱地土壤中筛选解磷细菌，在无机磷固体平板上分离得到一株能产生明显溶磷圈的菌株LQH-7，其溶磷指数为2.86，形态学、生理生化和基于16S rDNA基因序列的分子鉴定结果表明，LQH-7为维罗尼假单胞菌，与CIP 104663的同源性为99.65%。在初始pH为8.0，NaCl质量分数为0.5%的无机磷培养基中，30 ℃摇瓶发酵60 h，菌株LQH-7发酵液的pH为4.30，解磷量最高可达850.1 mg/L，说明该菌株在盐碱地土壤生物修复方面具有潜在的应用价值。

解磷菌；维罗尼假单胞菌；菌种鉴定；解磷能力

磷是植物生长不可缺少的元素，参与细胞代谢和能量传递，缺磷易造成植物生长缓慢、成熟延迟和产量降低[1]。农业生产中以施用化肥来增加土壤中的有效磷含量，但磷肥在土壤中的利用率很低，大量磷元素会转化为难溶性的磷酸盐而被土壤固定，造成土壤的潜在磷库很大，却仍然表现出“遗传学缺磷”[2]。解磷菌能将被土壤固定的难溶性磷转化为植物可利用的有效磷[3-4]，在农田中施用含有解磷菌的菌肥，在不增加土壤磷库的情况下，可提供更多的磷元素供作物生长，解磷菌还能在作物根际周围快速繁殖，抑制其他病原微生物的生长，减轻作物病害[5]。国内外研究者对解磷菌进行了大量研究，筛选到的解磷菌包括芽孢杆菌属（）、假单胞菌属（）、肠杆菌属（）、无色杆菌属（）、节杆菌属（）等的一些菌株[6-9]，这些解磷菌大多从普通土壤中筛选得到，对环境的适应范围有限，将解磷菌开发为菌肥就需要筛选适应不同土壤类型和温度条件的微生物[10-11]。本研究中将从盐碱地土壤中分离得到的一株高效解磷菌LQH-7进行分类鉴定，研究其解磷特性，以期为今后制作微生物菌剂提供菌种资源，并为解决盐碱地土壤固磷强度高的问题以及提高盐碱地作物产量提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样采自天津市滨海新区盐碱地土壤，北纬39°4'57"，东经117°42'8"。

细菌基因组DNA提取试剂盒、酶、质粒提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、pGM-T克隆试剂盒均购自北京天根公司，钼酸铵、丙酮酸钠、冰乙酸、抗坏血酸均为分析纯。

1.2 培养基

无机磷培养基（g/L）：葡萄糖10，硫酸铵0.5，酵母浸粉0.5，氯化钠0.3，氯化钾0.3，硫酸镁0.3，硫酸亚铁0.03，硫酸锰0.03，磷酸钙5，琼脂15，pH 9.0±0.2。

R2A培养基（g/L）：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酸水解酪素0.5，磷酸氢二钾0.3，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，硫酸镁0.05，琼脂15，pH 8.0±0.2。

LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 0.5，琼脂15，pH 7.0～7.5。

1.3 方法

1.3.1 解磷菌的筛选

取10 g土样，加90 mL无菌水涡旋振荡10 min，静置5 min后将上层悬液进行倍比稀释，取100 μL涂布于添加磷酸钙的无机磷培养基表面，30 ℃培养72 h，观察解磷圈。溶磷指数（SPI, soluble phosphorus index）＝（菌落直径＋解磷圈直径）/菌落直径。筛选SPI大的菌落进行分离纯化，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 菌种鉴定

1.3.2.1 菌株的形态学及生理生化特征测定

菌株的形态学观察及接触酶、脲酶、七叶苷水解、荧光色素和甲基红试验等生理生化指标的测定参考文献[12]进行。

1.3.2.2 菌株的16S rDNA基因序列测定及系统进化分析

利用细菌DNA提取试剂盒提取试验菌株的基因组DNA，采用细菌16S rDNA基因扩增通用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增， 95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物，与pGM-T载体连接后，转化至TOP10感受态细胞中，在含 IPTG和X-Gal的LB平板上37 ℃过夜培养，挑取白色单菌落，验证并送上海生工进行测序。将得到的16S rDNA序列与GenBank中的核酸数据进行BLAST比对，得到与其同源性较高的相关序列，用软件ClustalX 1.8对所获得的核苷酸序列进行分析，得到序列之间的相似值；利用软件 MEGA 2.0计算出序列的系统进化距离，用邻位相连法构建系统进化树[13]。

1.3.3 可溶性磷含量的测定

取1.0 mL发酵液，于4 ℃，10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释至合适倍数，用钼蓝比色法测定可溶性磷含量[14]，计算公式为：＝×15.91×。式中为发酵液中可溶磷含量（mg/L），为稀释倍数，为660 nm处吸光度值。

1.3.4 菌株LQH-7生长曲线及溶磷能力测定

取活化的菌株LQH-7接种于装有100 mL无机磷液体培养基的250 mL三角瓶中，置于摇床中30 ℃，150 r/min培养84 h，以不接种的培养基为对照，每隔12 h无菌取样，测定细胞浓度、pH值和可溶磷含量，每个样品3个重复。

1.3.5 菌株LQH-7最适溶磷pH的确定

调节无机磷液体培养基的初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，接种菌株LQH-7，30 ℃，150 r/min摇床培养60 h后测定细胞浓度、pH值和可溶磷含量，每个样品3次重复。

1.3.6 菌株LQH-7最适溶磷盐质量分数的确定

将菌株LQH-7分别接种于NaCl质量分数为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% pH为8.0的无机磷液体培养基中，30 ℃，150 r/min摇床培养60 h后，测定细胞浓度、pH值和可溶磷含量，每个样品3次重复。

2 结果与分析

2.1 解磷菌的筛选

取天津市滨海新区盐碱地土壤，用无机磷固体培养基平板进行解磷菌的分离筛选，得到1株能产生明显溶磷圈的细菌，其溶磷指数（SPI）为2.86（图1），将该菌株命名为LQH-7，并对其进行分类鉴定和解磷特性研究。

图1 菌株LQH-7的溶磷圈

2.2 菌株LQH-7的分类鉴定

2.2.1 菌株LQH-7的形态特征

在R2A平板培养基上30 ℃培养2 d，菌株LQH-7形成边缘整齐的白色菌落，表面光滑，凸起，直径4.5～5.0 mm。菌株LQH-7的细胞大小为（0.6～0.8）µm ×（2.0～3.5）µm，杆状（图2）、无芽孢、革兰氏阴性。

图2 菌株LQH-7的细胞形态（×1 000）

2.2.2 菌株LQH-7的16S rDNA序列测定及系统进化分析

扩增得到菌株LQH-7的16S rDNA序列，长度为1 422 bp，在GenBank中的序列登记号为MK734421。将该序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，得到与其同源性高的序列信息，进而进行ClustalX1.8比对，并利用软件MEGA 2.0的邻位相连法构建系统进化树（图3）。结果表明，菌株LQH-7属于属，与划分在同一个簇内，同源性最高的为

CIP 104663，达到99.65%，与CCM 2115同源性为99.02%，与ATCC 10844同源性为98.87%，根据目前的分子分类标准，判断菌株LQH-7为（维罗尼假单胞菌）。

图3 菌株LQH-7的16S rDNA序列系统进化树

2.2.3 菌株LQH-7的生理生化特征

菌株LQH-7的生长温度范围为4～39 ℃。由表1可知，该菌株产荧光色素，石蕊牛奶试验表现为酸凝现象，接触酶、淀粉酶、脲酶、酪蛋白水解、V-P试验、柠檬酸利用和吲哚产生为阳性；酯酶、甲基红试验、七叶苷水解呈阴性；与模式菌株CIP 104663在酯酶等指标上不同[15]。结合形态学、生理生化和基于16S rDNA的分子分类数据，确定菌株LQH-7为维罗尼假单胞菌，是与该种模式菌株不同的菌株。

表1 菌株LQH-7的生理生化特征

项目结果项目结果 接触酶＋V-P试验＋ 酯酶-淀粉酶＋ 柠檬酸盐利用＋吲哚产生＋ 甲基红试验-七叶苷水解- 酪蛋白水解＋石蕊牛奶酸凝 荧光色素＋脲酶＋

2.3 培养时间对菌株LQH-7解磷量的影响

由图4可知，菌株LQH-7在发酵培养36 h后达到最高菌量，细胞浓度为4.2×109cfu/mL，随着培养时间的延长，LQH-7培养液的pH也随之逐渐降低，培养60 h时，pH为4.67，此时解磷量最高，培养液中的可溶磷含量达到831.4 mg/L。60 h后培养液的pH稳定在4.50左右，由于细胞代谢活力的降低，菌株的溶磷量开始下降。

图4 培养时间对菌株LQH-7解磷量的影响

2.4 pH对菌株LQH-7解磷量的影响

在初始pH为4.0～11.0的培养基中进行LQH-7的发酵培养，结果如图5所示。由图5可以看出，pH在5.0～8.0 范围内，培养60 h后细胞浓度均处在较高水平，在3.6×109cfu/mL以上。但更高的初始pH影响细胞的生长，且发酵液的最终pH上升，解磷量随之下降。初始pH为8.0时，解磷量最高，比初始pH 7.0时的解磷量高9.4%，最终发酵液pH值为4.36。说明筛选得到的解磷菌LQH-7具有一定的耐碱性。

图5 初始pH对菌株LQH-7解磷量的影响

2.5 NaCl质量分数对菌株LQH-7解磷量的影响

菌株LQH-7的耐盐试验结果如图6所示。由图6可见，LQH-7解磷效果最佳时的NaCl质量分数为0.5%，此条件下的细胞浓度最高，为6.1×109cfu/mL，发酵液pH为4.30，可溶磷含量也达到最高，为850.1 mg/L。LQH-7细胞生长可以耐受的NaCl质量分数为2.5%，在盐质量分数为0～2.5%的条件下，LQH-7发酵液的最终pH均低于5.91，解磷量高于202.1 mg/L。当NaCl质量分数为3.0%时，菌株LQH-7的生长和解磷能力均被抑制，发酵液最终pH为6.40，细胞浓度和可溶磷含量分别为最高值的7.6%和14.9%。

图6 NaCl质量分数对菌株LQH-7解磷量的影响

3 结论

我国盐碱地总面积达9 913万hm2，约占全国土地面积的1/10[16]。磷元素利用率低是制约作物生长的主要因素之一。研究表明，解磷菌能够通过产生有机酸，释放土壤中固定的磷，为作物生长提供可利用的有效磷，同时降低作物根际的pH，增加作物的耐碱性[17]。假单胞菌是植物根系中较为活跃的一类解磷微生物，用作生物肥料可提高土壤中磷的利用率，增加作物产量。如，，，等对玉米、小麦、黄瓜、番茄都有较好的促生作用[18]，而维罗尼假单胞菌的相关研究尚未见报道。

本研究从天津市滨海新区盐碱土壤中筛选到一株高效解磷菌LQH-7，多项分类鉴定结果表明其为维罗尼假单胞菌（），在初始pH为8.0，NaCl质量分数为0.5%的条件下，解磷量可达850.1 mg/L，与国内外报道的一些高效解磷菌株PS-1[19]，P9[20]，RAF15[21]相比，LQH-7具有较高的解磷能力，且能适应中度盐渍化的土壤，说明筛选到的菌株在盐碱地生物修复中具有很好的应用潜力，对菌株LQH-7进行深入研究，可为适用于盐碱地的微生物肥料研发提供新的菌种资源。

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Isolation and identification of a high-efficiency phosphate solubilizingand its phosphate solubilizing characteristics

LIU Xi-min1, YANG Hai-xia1, HUANG Ling-xi1, LI Xiao-yan2, QUAN Gui-zhi1,YANG Hong-peng1, HUANG Hai-dong1, Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resources Environmentt, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Phosphorus is one of the important elements for plant growth. Plants cannot absorb enough phosphorus when a large amount of phosphorus in the soil exists in the form of insoluble state. To increase the utilization efficiency of phosphorus in saline-alkali, phosphate solubilizing bacteria were isolated from saline-alkali soil in Binhai New Area of Tianjin. Strain LQH-7, producing distinct soluble phosphorus circle with SPI 2.86, was isolated in inorganic phosphorus solid plate. Morphology, physiological-biochemical index and phylogenetic analysis based on 16S rDNA gene sequences showed that strain LQH-7 belonged to, exhibiting the highest sequence similarity withCIP 104663（99.65%）. In inorganic phosphorus medium，under the fermentation conditions in which the initial pH was 8.0, NaCl content was 0.5%, temperature was 30 ℃ and fermentation time was 60 h, pH of strain LQH-7 fermentation broth reached 4.30 and the phosphate-solubilizing quantity reached its highest value, 850.1 mg/L, suggesting that LQH-7 is a potent candidate for bioremediation of saline-alkali soil.

phosphate solubilizing bacteria;; identification of bacteria; phosphate solubilizing ability

1008-5394（2019）04-0049-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.010

S154.38

A

2019-06-27

国家级大学生创新创业训练计划项目（201910061002）

刘希旻（1998-），男，本科在读，研究方向：生物技术。E-mail：XmLiu19980119@163.com。

黄海东（1972-），男，教授，博士，研究方向：资源与应用微生物学。E-mail：hdhuang@tjau.edu.cn。

责任编辑：宗淑萍