万寿菊不定根发生中全蛋白双向电泳体系构建※

●李雪萍 金 鑫

（1.兰州新区现代农业发展研究院 甘肃 兰州 730300；2.临沂大学 山东 临沂 276005）

万寿菊（Tagetes erectaL.），又名臭芙蓉，为菊科万寿菊属植物。为了提高万寿菊的栽培观赏价值，研究者对万寿菊品种抗旱性[1]、耐盐性[2]进行了综合评价，并对干旱条件下促进万寿菊不定根的发生[3]进行了研究，并取得一定的研究成果。但对万寿菊不定根发生过程中蛋白质组学方面的研究尚未见报道。

双 向 电 泳（Two dimensional electrophoresis，2-DE）作为蛋白质组研究的核心技术之一，最早建立于1975年，该方法大大提高了蛋白质分离的分辨率和重复性[4]。本研究采用改良TCA/丙酮沉淀法，在膜蛋白和疏水性蛋白的提取方面进行了改善，对双向电泳的上样量、等电聚焦参数及分离胶浓度等条件进行了优化，得到适于万寿菊全蛋白分析的提取方法和双向电泳技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用万寿菊种子为泛美奇迹系列黄色，2021年2月购自兰州市甘肃新时代园林工程公司。参考Liao等[5]的方法，将万寿菊种子进行消毒，萌发5 d。控制好环境因子，萌发期间培养箱温度为（25±1）℃，每天光照14 h，光强为200 μmol/（s·m2）。培养 5 d 后的万寿菊幼苗，在下胚轴基部切去乳白色初生根，作为外植体在装有蒸馏水、0.1% PEG溶液（w/v）、PEG+NO （SNAP作为NO供体）和PEG+H2O2中继续培养3 h[6]后取样，用液氮速冻保存至-80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 TCA/丙酮法取4 g样品于研钵中，加入0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）用液氮研磨至粉末。用含0.7 g/L二硫苏糖醇（DTT）的丙酮溶液洗涤沉淀至颜色变白，沉淀真空干燥。加入裂解液室温裂解2 h，离心上清即为蛋白[7]。

1.2.2 改良TCA/丙酮法参照Damerval等[7]的方法并做修改。取2 g样品于研钵中，加入0.04 g PVPP，5倍体积的 Tris-Hcl（含1 mmol/L PMSF），混匀离心，取上清加入5倍体积TCA/丙酮［含10% TCA和0.07% β-巯基乙醇（β-ME）］，弃上清，沉淀用预冷丙酮（含0.07% β-ME）进行洗涤，干燥后加蛋白裂解液，其中DTT现加，离心上清即为蛋白。

1.2.3 蛋白定量参照Bradford方法进行蛋白定量，配制考马斯亮蓝（CBB）G-250染色液和牛血清蛋白（BSA）标准溶液，加超纯水配制不同浓度的蛋白溶液，加比色液测定其显色后的OD值，绘制标准曲线。在595 nm波长下测定蛋白样品的OD值，依据BSA标准曲线计算待测样品蛋白质的浓度[8]。

1.2.4 蛋白质双向电泳参考Bio-Rad 双向电泳操作手册，使用Bio-Rad Protean®i12TMIEF Cell系统，选取17 cm pH 4～7的线性胶条，上样量设为400 μg 和600 μg，加入水化上样缓冲液，补足至400 μL。设置IEF程序，开始第一向等电聚焦。设置每根胶条的极限电流50 μA，设置等点聚焦温度为20℃。聚焦结束后，立即开始胶条平衡，平衡结束后，开始第二向SDS-PAGE，再进行染色脱色。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取对万寿菊全蛋白含量的影响

图1中的maker是对照组（a），清晰度适中，中间2个不清晰的垂直电泳条带（b，c）是通过TCA/丙酮法提取万寿菊全蛋白得到的，右边2条清晰的垂直电泳条带（d，e）是通过改良TCA/丙酮法提取万寿菊全蛋白得到的，且改良后的垂直电泳条带明显有增加。因此，改良后的方法更适合万寿菊全蛋白的提取。

图1 万寿菊全蛋白不同提取方法的SDS-PAGE图谱

2.2 不同分离胶浓度对万寿菊蛋白质分离效果的影响

由图2所示，条带a分离胶浓度为10%时，蛋白分离过快，至电泳跑胶完成时，蛋白条带集中在尾部，且由于蛋白分离速度较快，分离区域长度无法满足；当分离胶浓度为15%（条带c）时，蛋白质分离过慢，至电泳跑胶完成时，胶的上部存在大量蛋白聚集，蛋白质未能充分分离；相比较而言，在浓度为12%（条带b）的分离胶中，对蛋白的分离效果最好，各分子量蛋白条带都较清晰的展现在SDS-PAGE图谱上。因此，分离胶浓度为12%时，最适合万寿菊全蛋白的分离。

图2 不同分离胶浓度对SDS-PAGE图谱的影响

2.3 不同蛋白上样量对2-DE图谱的影响

上样量对2-DE图谱具有较大影响，上样量过高或过低均不能满足双向电泳分析的需要，合适的上样量才能达到最佳的蛋白分离效果。试验设400 μg和600 μg 2个上样量进行双向电泳（图3）。上样量为400 μg，分离胶浓度为10%时，横条纹、竖条纹多，背景不够清晰，蛋白点有较为明显的拖尾，并且有些较大的斑点将周围低丰度蛋白斑点掩盖（图3-a）。上样量为400 μg，分离胶浓度为12%时，2-DE图谱的效果略有改善，但蛋白点分离不够清晰（图3-b）。上样量为600 μg，分离胶浓度为12%时，一些低丰度蛋白得到充分分离且各丰度蛋白点得到均匀的分布，2-DE图谱背景清晰，存在较小扩散及拖尾现象（图3-c）。因此，选择600 μg上样量、12%分离胶浓度进行双向电泳分析可达到较好的分离效果。

图3 不同上样量对2-DE图谱的影响

3 讨论

本试验参照Wang等[9]的方法，选定65 mmol/L DTT加入水化上样缓冲液和裂解液，是为了保护二硫键并促进其溶解，两性离子去污剂CHAPS能显著提高蛋白质的溶解性，所以在裂解液中添加了4%的CHAPS 促进蛋白质溶解。

蛋白质分离的清晰度很大程度上由分离胶浓度决定，若胶的浓度较低，虽然蛋白质点能够较好地分离，但会丢失分子量较小的蛋白；若胶浓度过高，蛋白质分离不够清晰且有的蛋白点会出现重叠[10]。对于番茄子叶[11]等多数植物组织来说 ，12% 的分离胶浓度较适合其蛋白质的分离，本研究也得出浓度为12%的分离胶更适合万寿菊幼苗全蛋白的分离。

上样量的大小直接影响蛋白点的获取和双向电泳的分辨率。合适的上样量有利于蛋白的分离，并且在凝胶图谱上清晰地显现更多不同分子量的蛋白。在番茄子叶总蛋白双向电泳的研究中，选择300 μg为最适上样量[11]；向日葵种子蛋白双向电泳中，选择1000 μg为最佳上样量[12]。在本研究中，当上样量达到600 μg时，2-DE 蛋白质图谱的分辨率较高，而且一些低丰度蛋白得以显现，因此，600 μg上样量足以进行后续研究。