CAR-T免疫疗法在靶向性治疗实体肿瘤的研究进展

金沁远

摘 要：CAR-T是目前非常热门的治疗肿瘤的一种免疫治疗策略，并且在治疗血液肿瘤方面取得了良好的效果，但其在实体肿瘤的治疗方面的研究过程却进展十分缓慢。本文就CAR-T疗法在肝细胞癌所分泌的GPC3、CD133的抗原蛋白，神经母细胞瘤所分泌的CD2、GD2的抗原蛋白，非小细胞肺癌所分泌的EaphA2、MU-C1、PSCA的抗原蛋白以及恶性胶质瘤所分泌的IL13Rα2，、EGFRIII的抗原蛋白的近期所进行的最新的研究进行了综述。

关键词：CAR-T细胞疗法;肝细胞癌 ;神经母细胞瘤;胶质瘤;小细胞肺癌;研究进展综述

恶性肿瘤是目前危害世界人民的健康安全的一大难题。恶性肿瘤拥有能自行产生生长信号分子进行无限的自我复制，浸润性生长等特性。因此，彻底地治疗恶性肿瘤现如今已成为了医学界的一大难题。正因为恶性肿瘤的种种特性导致市面上的能特效的针对肿瘤细胞的药物数量极少，同时由于生产和研发成本较高，大多数药物的治疗费用老百姓难以承担，这也是目前恶性肿瘤在农村和城镇能有如此高的致死率的原因之一。根据近几年的卫生和计划生育统计年鉴所调研的数据显示，城镇和乡村人口因肿瘤而死亡的人口数目已达到总死亡人数的26.06%，仅次于循环系统疾病的死亡率，是影响我国人民的生命健康安全的第二大“敌人”。而在这其中，肝癌、肺癌和胃癌这几种实体肿瘤的致死率在恶性肿瘤中排行最高，分别为22.70%、47.84%和18.78%[2]。

本文所介绍的CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherap）免疫疗法是目前市面上最热门的针对肿瘤的免疫治疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法在针对血液肿瘤的治疗中取得了良好的进展，但其针对实体肿瘤的研究进展十分得缓慢，导致这一现状的最主要的原因在于，血液肿瘤分泌的特异性抗原在身体的其他部位很少表达，例如B细胞费霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）表达的CD20，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）表达的CD138等等，但是类似于血液肿瘤这种特异性表达的抗原在实体肿瘤中却十分的少见，这是CAR-T细胞疗法应用于血液肿瘤具有良好的成效的原因。

因此，本研究的主要目的便是对CAR-T细胞疗法在不同实体肿瘤中的研究的最新进展进行综述。

一、CAR-T细胞疗法的分子基础和发展历程

CAR分子的概念最早是于1989年由Gross提出的。其主要由T细胞受体（T cell receptor，TCR）的胞内信号区，跨膜区以和胞外抗原结合区组成，而这个胞外区具有抗体单链可变区片段功能。[2]这一技术的关键在于使转载了CAR分子的T细胞能特异性的地识别并結合肿瘤相关抗原，例如肾细胞癌分泌的CAIX，肺癌和卵巢癌分泌的Lewis Y以及在黑色素瘤、成细胞纤维瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、软组织肉瘤等肿瘤中高度表达的神经节苷脂2（diasialoganglioside，GD2）等等，以使T细胞能在监测到带有特异性靶点抗原的肿瘤细胞时活化产生具有杀伤力的细胞毒性因子，以此来实现靶向性地消灭目标的肿瘤细胞并能实现含有CAR分子的T细胞的自我增殖，从而在人体内能长时间的存在并杀死目的肿瘤细胞。

一代的CAR-T细胞由于缺少共刺激分子，无法有效地实现CAR-T细胞在体内的持续的增殖，而二代的CAR-T细胞增加了共刺激分子，例如CD28，4-1BB，OX40等等，使CAR-T细胞的抗肿瘤活性得到了显著的提高，在三代的CAR-T细胞里，研究人员又增加了一个共刺激分子的信号传导结构，其细胞活性以及杀伤力均优于二代，同时，最新的一代CAR-T细胞，也就是第四代CAR-T细胞，研究人员通过联合细胞因子或共刺激分子的配体改善免疫微环境，从而进一步增强其活性与杀伤力。[3]

目前医学上对CAR-T细胞临床应用的主要操作方法为先将含有CAR分子的载体转染进入T细胞中，再将改造后的T细胞进行体外的增殖，最后将增殖后的含有CAR分子的T细胞在输入已经过预处理的患者体内，此过程称为重新引导T细胞攻击肿瘤细胞。[4]目前在市面上经过美国食品药品监督管理局审批通过并已上市的CAR-T细胞疗法药物主要有两个，分别为Kymriah和Yescarta。

CAR-T细胞疗法在针对血液肿瘤的治疗中取得了良好的进展，但其针对实体肿瘤的研究进展十分的缓慢。目前，主要在肝细胞癌、神经母细胞瘤、胶质瘤、小细胞肺癌等方面取得相关进展。

二、CAR-T细胞疗法在肝细胞癌中的研究进展

根据2016年的中国卫生和计划生育统计年鉴统计，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是首要的导致城镇居民死亡的癌症，其发病和致死的人群主要集中在25岁以上的成年人群。引起肝癌的主要外部因素为感染肝炎病毒，而其中乙型肝炎又是其中最为常见的一种肝炎病毒（HBV）。根据不完全统计，在我国患有乙型肝炎的人数约有1.2亿人之多。而在内部因素中，嗜酒与长期进食霉变食物是引起肝癌的重要因素。在此前，治疗肝癌的主要途径通过化疗，手术切除，以及肝移植等综合性治疗。同时，目前市面上主流的口服的多靶向性肿瘤治疗药物索拉非尼（Sorafenib）只能将患者的生存时间延长2～3个月。而本文所介绍的CAR-T免疫疗法则是通过诱导自身的免疫细胞来特异性杀死癌变的细胞来进行肝癌的治疗，并能够有效的规避之前的综合性疗法以及药物治疗所带来的部分副反应。目前CAR-T免疫疗法针对HCC所适用的特异性抗原主要有：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3），CD133。

吴斯玮等[5]运用了GPC3作为特异性抗原所构建的CAR-T细胞经过实验证明在GPC3-CAR-T细胞与阳性Huh-7细胞进行接触时会有大量的LDH释放，表明GPC3-CAR-T对其有杀伤作用，且其效靶比为4：1，能很好的针对HCC进行治疗。

Yao Wang等利用二代CAR分子，并以CD133为特异性抗原，构建了CD133-CAR-T细胞。在之后的研究中显示，CD133-CAR-T细胞能在拥有CD133的血液环境中分裂，同时，能显著的观察到试管内的CD133的数量在减少，由此证明，CD133可以作为CAR-T免疫疗法用于治疗HCC的一个潜在的靶向性抗原。

三、CAR-T细胞疗法在神经母细胞瘤中的研究进展

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是一种常见的儿童颅外肿瘤。NB的发病和致死率在每10万人中的4人，且发病人群主要为1至5岁的幼儿为主。同时NB的预后差，严重的危害了幼儿的成长。NB的主要的治疗方法为通过将血管进行骨骼化，再通过手术切除的方法进行治疗。而CAR-T免疫疗法则能很好地避免手术切除带来的风险，保护患儿的生命安全。目前CAR-T细胞疗法最有效的针对神经母细胞瘤所选用的特异性抗原主要有CD2，GD2。Pule等运用一代的CAR分子，并以GD2作为特异性的抗原靶点，设计出了GD2-CAR-T细胞用于治疗NB，并成功地使11例难治疗的患者的症状得到了缓解，并且其中的4例患者的肿瘤细胞可以明显的观察到消退，由此证明GD2-CAR-T是一个有效的针对NB的特异性抗原。Louis等则设计出了以CD2为特异性靶点的CAR-T细胞并用于治疗19例NB患者，成功的使其中的8例的症状得到了有效的缓解。Paola Bocca等通过利用OTK3和CD28抗体和白细胞介素-7（IL7）（10ng/ml）和白细胞介素-15（5ng/ml）在完全培养基中活化，并在第三天时，用逆转录病毒上清液活化的T细胞转导到涂有重组bronectin片段的培养皿上，最后通过使用IL7-IL15扩增T细胞，以此获取实验用的T细胞。选择GD2作为特异性抗原，以此来构建了GD2-CAR-T细胞。在后续的实验中，将GD2-CAR-T细胞与BEV联合使用，并且观察到只有当GD2-CAR-T细胞与BEV联合使用时，才具有抗NB活性，同时能大量的侵袭肿瘤组织，并且能检测到干扰素-g（IFN-g）的产生。这次试验可以为后续的GD2-CAR-T细胞与BEV联合使用于NB的临床治疗中提供了强有力的理论基础。

四、CAR-T细胞疗法在恶性胶质瘤中的研究进展

恶性胶质瘤（Glioblastoma，GBM）是一种常见的颅内恶性肿瘤，年发病率为每十万人中3至8人。（1）虽然通过手术可以将比较低级别的胶质瘤完全的切除，但由于GBM预后很差，以及其浸润行为，导致手术很难彻底地切除GBM。而目前市面上主流的GBM的化疗药物替莫唑胺（Temozolomide）又只能将患者的生存时间延长2个月左右，并不能完全的治愈GBM患者。在CAR-T免疫疗法的研究中，由于GBM所分泌的特异性抗原在身体的其他部位几乎不表达，因此，有希望通过CAR-T免疫疗法来抑制或彻底杀死GBM，以此来规避手术切除可能会留下的创伤。

目前CAR-T免疫疗法针对于胶质瘤所用的特异性抗原主要有：EGFRIII，白细胞介素13受体α2（interleukin-13 receptor alpha 2， IL13Rα2）等。

郑岩等利用了EGFRIII所构建的CAR分子所进行的针对胶质瘤的杀伤作用的实验显示当EGFRIII-CAR-T细胞的效靶比为4：1，8：1，16：1，32：1時，其对于胶质瘤的杀伤活性超过了50%，由此可以看出，EGFRIII是一个有效的针对胶质瘤的特异性抗原。

Christine等利用IL13Rα2作为特异性抗原构建CARs，并在三例恶性胶质瘤患者的免疫治疗中取得了良好的效果，在后续的肿瘤治疗过程中，也能持续观察到患者体内IL13Rα2的表达收到了抑制。同时发现，当IL13Rα2-CAR-T的累积使用剂量达到10.6×10个T细胞时，能有效的缓解病症。

五、CAR-T细胞疗法在非小细胞肺癌中的研究进展

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种肺部的恶性癌症，其致病原因与吸烟有着密切的关系，目前，我国的吸烟者达到了3.01亿人，同时，我国的肺癌的发病率达到了每年26.9%。肺癌的致死率也极高，为每10万人中的23人。肺癌的主要的发病症状为咳嗽，咯血，胸闷气急以及声带嘶哑。在此之前，NSCLC的治疗方式为放疗，但由于放疗在杀死癌变细胞的同时，也对身体内的其他的正常的组织和细胞产生了巨大的危害。但是CAR-T免疫疗法能很好地规避其部分的副作用。

Ning Li等的研究显示Erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma A2（EphA2）在SCLC中过度表达超过90%，因此，他们选用EphA2作为特异性靶点，使用拥有一个共刺激分子41-BB的二代CAR分子来构建了CAR分子，并观察到EphA2-CAR-T细胞在患有NSCLC的小鼠模型体内表达出了IFN-y，但在48h后，可以明显得检测到EphA2-CAR-T细胞的细胞数量的减少。

Xinru Wei等运用二代拥有两个共刺激分子CD28和CD3z的CAR分子并选用MU-C1和PSCA作为特异性抗原构建了CAR-T细胞。同时利用6～8周年龄并移植了原发性肿瘤块的小鼠的NOD-SCID-IL2Rg/株（NSI），以此来产生人造的NSCLC PDX小鼠并进行试验，他们发现在8例小鼠模型仅有两例表达了MU-C1，然而有七例包括表达出MU-C1的两例小鼠大量表达PSCA。在之后对这8例小鼠所进行的试验结果显示PSCA-CAR-T细胞以及MU-C1-CAR-T细胞均能有效的抑制小鼠模型中的NSCLC细胞的生长。

六、结语

CAR-T细胞疗法是目前最有希望能根治肿瘤的免疫疗法，其副反应小，治疗彻底等优势为癌症病人带来了福音。但只有在克服细胞因子风暴、脱靶效应以及特异性抗原的选择等难题后，才能真正的使癌症的治疗迈上一个新的台阶。因此，虽然CAR-T细胞疗法的前景十分的明朗，但其仍需要进行大量的研究。

参考文献

[1] 陈伟.2016吉林省卫生和计划生育统计年鉴.出版[J].吉林医学信息，2016，32（12）：9.

[2] Cheadle EJ，Gornall H， Baldan V，et al. CAR T cells： driving the road from the laboratory to the clinic[J].Immunol Rev，2014，257 （1）：91-106.

[3] 葛玉凤，韩东晖，吴介恒，杨发，谢品，秦卫军，杨安钢，温伟红.CAR-T细胞治疗用于实体瘤的研究进展[J].转化医学电子杂志，2017，4（10）：50-55.

[4] 赵玲娣，高全立.CAR-T细胞在肿瘤治疗中的研究进展[J].中国肿瘤临床，2015，v.4203：190-194.

[5] 吴斯玮，敖翔，郭韡，邢伟，安天琛，敖罗权，胡雪停，李战，徐祥.靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞的构建与功能鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2017，24（07）：748-755.