健骨颗粒的质量标准研究

李 翔，黎春彤，张晓娟，段斯庭，刘皈阳，马建丽

0 引言

健骨颗粒为解放军总医院第四医学中心制剂室自制，由骨碎补、黄芪、土鳖虫、三七、栀子和海螵蛸共六味药材构成，用于对骨折、跌打损伤及骨质疏松等常见疾病的治疗，该药物临床应用多年，疗效显著、安全性高。但目前健骨颗粒的质量控制多以单一药物成分或活性成分鉴别为主，缺乏准确、可靠的质量标准，需建立和完善其质量标准，以有效控制药品质量、保证药品安全。本研究对健骨颗粒开展了骨碎补、黄芪、土鳖虫、三七和栀子的薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱法对君药骨碎补中柚皮苷的含量进行控制，对该制剂的质量标准进行全面提升，所建立的方法简便、准确、重复性好，能够更加全面地反映制剂的质量和保证制剂安全。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，ChemStation化学工作站(美国安捷伦公司)；Linomat 5半自动点样仪(瑞士卡玛)；AE200型电子天平；KQ3200DB型数控超声波清洗器；ZF-90暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)。

1.2 试药和材料 健骨颗粒(批号：20180301、20180308、20180315，解放军总医院第四医学中心)；对照药材：骨碎补(批号：121169-201304，中国药品生物制品检定所)，黄芪(批号：121464-201304)、土鳖虫(批号：121533-201303)、三七(批号：120941-200405)、栀子(批号：120986-201309)；对照品：柚皮苷(批号：0722-9805)、黄芪甲苷(批号：0781-9807)、三七皂苷R1(批号：110745-200617)、人参皂苷Rg1(批号：0703-200118)、人参皂苷Rb1(批号：110704-200217)、栀子苷(批号：110749-201316)均购于中国食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水；甲醇为色谱纯、磷酸为分析纯；德国默克硅胶G60高效薄层板(德国Merck)。

2 薄层色谱鉴别

2.1 供试品溶液、对照药材溶液和空白对照溶液的制备 取健骨颗粒2 g，分别按照表1方法制备3份供试品，作为供试品溶液1～3，分别用于骨碎补、黄芪、土鳖虫、三七和栀子的薄层鉴别。取骨碎补、栀子、土鳖虫、三七和黄芪对照药材各0.5 g，同法制得相应的对照药材溶液。另按处方比例分别制备缺骨碎补、黄芪、土鳖虫、三七和栀子的阴性对照品，同法制成阴性对照品溶液，结果见表1。

2.2 标准品溶液的配制 取对照品柚皮苷、黄芪甲苷、栀子苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1，分别加甲醇制成1～2 mg/ml的溶液，作为骨碎补、黄芪、三七和栀子薄层鉴别的对照品溶液。

2.3 骨碎补、黄芪、土鳖虫、三七和栀子的薄层色谱鉴别 分别吸取供试品、对照药材、对照品和阴性对照品溶液按照表1中色谱条件进行薄层鉴别实验。结果见图1。

表1 薄层鉴别色谱条件表

图1 TLC鉴别结果

注：A.骨碎补的TLC图谱；B.黄芪的TLC图谱；C.三七的TLC图谱(可见光)；D.三七的TLC图谱(紫外)；E.栀子的TLC图谱；F.土鳖虫的TLC图谱。1.健骨颗粒(20180301)样品；2.对照药材；图A中，3.柚皮苷对照品，4.缺骨碎补的阴性样品；图B中，3.黄芪甲苷对照品，4.缺黄芪的阴性样品；图C、D中，3.混合对照品，4.人参皂苷Rb1对照品，5.三七皂苷R1对照品，6.人参皂苷Rg1对照品，7.缺三七的阴性样品；图E中，3.栀子苷对照品，4.缺栀子的阴性样品；图F中，3.缺土鳖虫的阴性样品

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液(40∶60)；流速：1.0 ml/min；检测波长：283 nm；进样量：10 μl；理论塔板数：按柚皮苷不得低于1 000。

3.2 溶液制备 对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l ml含61.44 μg/ml的溶液，即得对照品溶液。供试品溶液的制备：精密称量健骨颗粒内容物1 g，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，称定重量，超声处理30 min，放置到室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；取2.5 ml置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液，即得供试品溶液。阴性对照溶液的制备：取薄层鉴别制备缺骨碎补的阴性对照样品，按照供试品溶液的制备项下方法制备成缺骨碎补的阴性对照溶液。

3.3 专属性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定，结果样品中柚皮苷峰与其他组分色谱峰能达到基线分离，阴性对照液中色谱峰对测定无干扰，结果见图2。

图2 健骨颗粒的HPLC图谱

3.4 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 ml，分别加甲醇稀释至10 ml，即为不同浓度的对照溶液。按“3.1”项下色谱条件分析，以浓度为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果线性方程为Y=17.984 X+5.824，柚皮苷在3.072～61.44 μg/ml范围内与峰面积的线性关系良好(r=0.999 9)。

3.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“3.1”项下条件连续进样6次进行测定，计算柚皮苷峰面积的RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

3.6 重复性试验 取健骨颗粒(批号：20180301)，按“3.2”项下供试品溶液方法制备6份溶液，按“3.1”项下色谱条件分别进样进行分析。结果柚皮苷的平均含量为3.556 1 mg/g，RSD为0.97%(n=6)，表明方法重复性良好。

3.7 样品溶液稳定性试验 健骨颗粒(批号：20180301)样品，按“3.2”项下供试品溶液方法制备，分别于0、2、4、6、8、12 h后进样，按“3.1”项下色谱条件分析测定，以峰面积计算。结果柚皮苷的RSD为0.81%，表明供试品在12 h内具有良好的稳定性。

3.8 回收率试验 精密量取已知含量(柚皮苷3.556 1 mg/g)的健骨颗粒6份，精密加入8.2 ml的柚皮苷对照品溶液，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，依“3.1”项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果显示，该色谱条件下柚皮苷的平均回收率为99.92%，RSD为1.53%，结果见表2。

3.9 样品含量测定及耐用性实验 样品含量测定：取健骨颗粒样品3批(批号：20180301、20180308、20180315)，按“3.2”项方法制备供试品溶液，按“3.1”项色谱条件对柚皮苷的含量进行测定(n=3)，3批样品中柚皮苷的含量结果见表3。

耐用性实验：取健骨颗粒(批号：20180301)供试品，照“3.2”项下方法制备供试品溶液。对改变色谱柱进行了考察。两种不同色谱柱对比：以1批号(20180301)健骨颗粒样品试验，比较色谱柱Agilent ZORBA XSB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)的分离状态和测定结果，表明该方法适用于多个型号的C18色谱柱。

4 讨论

本制剂处方来自民间验方，具有活血化瘀、补肾接骨之功效。经多年临床经验证明，疗效确切、治愈率高，安全可靠。对骨折、跌打损伤、骨质疏松等临床常见疾病有良好疗效。筋断骨折，血不循经，总致瘀血在内而不散，血不活则瘀不能去，瘀不散则骨折不续，而肝主筋，肾主骨，尤以肾为最要，肾精充足则骨髓生化有源，对骨骼的生长发育以及骨折后的修复发挥重要作用，故本方立法于活血化瘀，补肾接骨。骨碎补苦温，补肾强骨[1-2]；土鳖虫咸温，性善走窜攻冲，破血逐瘀，续筋接骨，二者共为君药[3-4]。黄芪甘温益气，与活血药共用[5]；海螵蛸咸涩微温，收敛止血，中含大量钙质，为骨之修复所必须，与黄芪共为臣药[6]。瘀血内阻，易化热，栀子正可用其清凉之性以清热，是为佐药[7]。三七味甘，微苦，归肝、胃经，散淤止痛，消肿止痛，是为使药[8]。本研究对制剂处方中的骨碎补、黄芪、栀子、三七和土鳖虫进行了薄层鉴别研究，并取得了理想的鉴别效果，其中未鉴别的海螵蛸的主要成分为无机成分碳酸钙，可参考中国药典中化学鉴别法，不宜采用薄层法鉴别[9]。本研究采用高效液相色谱法，对其中柚皮苷进行了含量测定。骨碎补为健骨颗粒中的君药，具有治疗伤筋动骨、抗骨质疏松、促进骨折愈合的功效，骨碎补的主要成分柚皮苷，可作为定量检测的指标性成分。

表2 样品回收率试验结果

表3 含量测定结果

在对骨碎补的薄层鉴别方法进行考察时，原标准中以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)上层溶液为展开剂。由于甲苯毒性较强，用毒性较小的环己烷代替同样能达到较好的分离效果。但在这个条件下，薄层板下边变黑，经验证，是甲酸含量高导致。所以参考了药典中枳壳薄层鉴别的条件，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)的下层溶液为展开剂，同样，由于三氯甲烷为明确的致癌物，将三氯甲烷替换为二氯甲烷，最终展开结果相似。虽然各成分得到分离，但经计算，比移值偏大[9]。所以将展开剂的比例调整为二氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.5)，最终获得较好的分离效果。

5 结论

本实验方法简便、准确，通过对健骨颗粒的质量标准研究，为其质量控制提供了可靠依据。用显微鉴别的方法，用薄层色谱法对骨碎补、黄芪、栀子、三七和土鳖虫进行鉴别，特征斑点分离明显，阴性无干扰；柚皮苷在3.072～61.44 μg/ml范围内与峰面积的线性关系良好(r=0.999 9)，平均回收率为99.92%，平均RSD为1.53%(n=6)，该方法适用于健骨颗粒中柚皮苷含量测定。