鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法的建立及初步应用

张文 徐立蒲 吕晓楠 王小亮 王 姝 王静波 曹欢

（北京市水产技术推广站 北京 100176）

1 前言

锦鲤（Cyprinus Carpio Var Koi）是我国主要观赏鱼养殖品种之一，在观赏鱼国际贸易中占较大比重，具有重要的经济价值[1-3]。随着我国锦鲤养殖规模的不断扩大，疫病的频繁出现也制约了观赏鱼养殖产业的健康发展。锦鲤对多种病原易感，据研究可引起锦鲤大面积死亡的主要病原是鲤浮肿病毒（Carp Edema Virus，CEV）和锦鲤疱疹病毒（Kio Herpes Virus，KHV）[4]。CEV是大小约为200nm×400nm的双链DNA，属痘病毒[5]。KHV是直径167～200 nm的双链DNA，属疱疹病毒[6，7]。这2种病毒引起的症状极其相似，包括烂鳃、眼球凹陷等，死亡率高达80%～100%[8，9]。因此，当养殖锦鲤出现烂鳃、凹眼等症状，并有较高死亡率时，根据现场调查症状和流行特点很难区分这2种病毒病，还需尽快进行实验室检测。分子生物学方法是实验室最常用的检测CEV和KHV 的方法。对于CEV，Oyamatsu等[10]建立了nest-PCR方法，该方法适合于锦鲤的检测[11]。对于KHV、PCR检测方法是世界动物卫生组织（OIE）水生动物疾病诊断手册上优先推荐的方法。目前，实验室通常采用SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》行业标准同时扩增TK基因和 Sph基因来检测该病毒[12，13]。

鉴于CEV和KHV引起的发病锦鲤症状极其相似，针对同一临床样品需要分别检测CEV和KHV这2种病原，为提高实验室检测效率，尽快确诊病原，本研究建立了可同时检测锦鲤样品中CEV和KHV的三重PCR检测方法，为鲤浮肿病毒病（CEVD）和锦鲤疱疹病毒病（KHVD）这2种常见鱼类疫病的快速诊断及有效防控提供必要的技术支持。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株

CEV、KHV、金鱼造血器官坏死病毒（Goldfish Haematopoietic Necrosis Virus，GFHNV）、 流行性造血器官坏死病毒（Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus，EHNV）、蛙虹彩病毒（Bohle Iridovirus Virus，BIV）、斑点叉尾鮰病毒 （Channel Catfish Virus，CCV）（由北京市水产技术推广站鉴定保存）、白斑综合征病毒 （White Spot Syndrome Virus，WSSV）、虾肝肠胞虫 （Enterocytozoon Hepato Penaei，EHP）（购自中国水产科学研究院黄海水产研究所）。

2.1.2 主要试剂与仪器

DNA抽提试剂盒（QIAGEN公司）；DNA扩增试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；梯度PCR仪（Life Technologies公司）。

2.2 方法

2.2.1 引物的选择与合成

根据Oyamatsu等建立的nest-PCR方法和锦鲤疱疹病毒行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒》公布的方法，选择扩增CEV P4a基因548 bp片段、KHV TK基因409 bp片段和KHV Sph基因292 bp片段的3对特异性引物，引物序列见表1，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列

2.2.2 标准品的制备

参照DNA抽提试剂盒说明书，提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，送至北京天成新脉生物技术有限公司，合成CEV P4a基因序列（548 bp），克隆到pEASY-T1载体。合成KHV TK基因序列（409 bp）和 KHV Sph 基因序列（292 bp），克隆到PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数。

2.2.3 三重PCR退火温度及引物浓度优化

参照DNA扩增试剂盒说明书，单重PCR扩增反应的反应体系见表2，反应程序为：95℃预变性4 min，95℃变性 1 min， 适宜温度退火 1 min，72℃延伸1 min，35个循环后72℃延伸10 min。

表2 单重PCR反应体系

在单重PCR反应条件基础上，分别加入质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph各2.5μL作为模板，退火温度设置为 43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃进行三重 PCR 扩增，根据条带强弱确定最佳退火温度。在此基础上，设 置 每 对 引 物 终 浓 度 为 0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L 6 个梯度，组合后分别进行三重PCR扩增，根据条带强弱、有无杂带确定最佳引物终浓度。

2.2.4 敏感性试验

对质粒 CEV P4a、KHV TK和KHV Sph分别进行10倍系列稀释，按照2.2.3所述的方法进行单重和三重PCR扩增，验证检测方法的敏感性。

2.2.5 特异性试验

分别以质粒 CEV-P4a、KHV-TK和 KHV-Sph作为模板，同时加入3对特异性引物，按照优化好的反应条件进行三重单检PCR扩增，验证引物间是否存在交叉反应。同时采用建立的方法，对GFHNV、EHNV、CCV等DNA病毒进行特异性验证。

2.2.6 临床样品检测应用

采用本研究建立的三重PCR方法，检测本实验室鉴定保存的20份样品，评价该方法的可靠性。

3 结果

3.1 反应条件的优化

通过设置不同退火温度进行三重PCR扩增，可知退火温度为53℃，目的条带最清晰且背景干净，见图1。设置不同引物终浓度进行三重PCR扩增，结果显示，当引物终浓度均为0.3 μmol/L时，目的条带最明显。因此，优化好的反应体系为：2×Master Mix 25 μL，3 对特异性引物终浓度 0.3 μmol/L，模板2.5μL，补水至50μL。反应程序为：95℃预变性4 min，95℃变性1min，53℃退火 1min，72℃延伸 1min，35 个循环后72℃延伸10 min。

图1 不同退火温度的扩增结果

3.2 敏感性试验结果

以10倍系列稀释的质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph作为模板，分别进行单重PCR检测,结果显示 3种质粒的检测限分别为 300 copies/μL、30 copies/μL、30 copies/μL，见图 2；进行三重 PCR 检测，结果显示3种质粒的检测限均为300 copies/μL，与单重PCR相比，KHV敏感性有所下降，见图3。

3.3 特异性试验结果

图2 单重PCR敏感性试验

图3 三重PCR敏感性试验

当反应体系中只加入CEV P4a、KHV TK和 KHV Sph中任意2种质粒作为模板，采用本研究建立的方法进行PCR扩增时，结果仅得到相应模板的目的条带，表明引物间没有交叉反应，见图4。以GFHNV、EHNV、CCV等多种DNA病毒核酸作为模板进行三重PCR扩增，结果均没有目的条带，见图5。

3.4 临床样品检测结果

图4 任意2种质粒作为模板三重PCR扩增

图5 特异性试验

采用本研究建立的三重PCR法，对实验室鉴定保藏的20份锦鲤样品进行检测，验证方法的可靠性。其中有13份样品经英国环境、渔业和水产养殖科学中心（CEFAS）建立的荧光PCR鉴定为CEV阳性，7份样品经SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒》行业标准鉴定为KHV阳性。三重PCR扩增结果显示，13份CEV阳性样品中，只有4份有548 bp目的条带，参考日本学者Oyamatsu等建立的nest-PCR方法，采用该方法中的套式引物对其余9份样品进行套式扩增，结果均有180 bp目的条带。虽然这9份样品经三重PCR扩增没有548 bp目的条带，但经套式PCR可扩增出180 bp条带，说明第一步可以扩增出微量的PCR产物，或产生了错误片段。7份KHV阳性样品均能够同时扩增出409 bp和292 bp 2条目的条带，结果见表3。

表3 临床样品检测结果

（续表3）

4 讨论

KHVD是OIE必须申报的国家二类动物疫病，自2002年在我国大陆进口的锦鲤中发现KHV至今，我国多地鲤（Cyprinus Carpio Linnaeus）及锦鲤养殖场均有KHV感染的报道，给我国鲤及锦鲤养殖业造成了严重的经济损失[14]。CEVD是2016年在我国首次被确诊的可感染鲤和锦鲤临床症状与KHVD极其相似的鱼类病毒病[15-17]，死亡率在80%以上，已在我国多地爆发流行[18]，同样制约了鲤及锦鲤养殖产业的发展。目前，针对CEVD和KHVD尚没有有效的治疗措施，提高检测效率，尽早确诊病原，为疫病防控提供必要依据则具有重要意义。目前，还没有筛选到能够稳定易感CEV的敏感细胞系，主要依靠PCR方法检测CEV。有研究表明，Oyamatsu等和英国CEFAS建立的套式PCR都存在漏检现象[19，20]，其中，Oyamatsu 建立的方法适用于锦鲤的检测，而检测鲤时有漏检情况。英国CEFAS建立的实时荧光定量PCR是目前最适用于检测CEV的方法，更适用于CEV的常规监测。但是荧光PCR的扩增产物长度只有76 bp,测序后无法通过序列比对进行相似性和同源性分析，导致相关数据缺失，且一般普通实验室不具备该设备。针对KHV的敏感细胞系已有大量报道，但通常需要传代3～5次，每次培养时间约为2周，分离培养时间较长，且首次分离成功的很少，故普通PCR检测方法依然是诊断KHV首选。综合考虑上述因素，本研究建立了针对锦鲤样品可同时检测CEV和KHV的三重PCR检测方法。

目前，PCR技术因快速、灵敏、特异等特点早已被广泛应用。多重PCR是在单重PCR基础上，在同一反应体系中，同时加入多对特异性引物，扩增多个目的基因的技术手段[21-23]。在实际检测工作中，当样品量非常大时，与单重PCR相比，多重PCR高效、简便等特点则具有明显优势。但多重PCR对扩增条件、引物序列、扩增产物大小等要求较高[24]，需要对反应条件、引物浓度等进行优化，以提高反应的扩增效率。

本研究选择扩增CEV P4a基因548 bp、扩增KHV TK基因409bp及扩增KHV Sph基因292bp的3对特异性引物，通过优化退火温度和引物浓度，初步建立了鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法。敏感性试验结果显示，KHV敏感性有所下降，推测引物间的相互竞争可能是导致三重PCR敏感性有所下降重要原因。与实验室普通单重PCR检测方法相比，该方法大大缩短了检测时间，提高了检测效率，实现了一管多检；扩增产物可直接测序，可进行序列相似性和同源性分析；有较高的敏感性，检测限为300 copies/μL；有良好的特异性，引物间不发生交叉反应，以其他鱼类DNA病毒作为模板进行扩增，没有目的条带。

临床样品检测结果表明，采用本研究建立的三重PCR方法检测KHV，结果与实验室常规方法检测结果一致。检测CEV时，只有4份样品扩增出目的条带，参考日本学者Oyamatsu等建立的nest-PCR方法对其余样品的扩增产物进行套式扩增，有9份样品可获得180 bp目的条带，证明有13份CEV阳性样品，与实验室采用荧光定量PCR检测方法结果一致。分析原因，扩增548 bp的引物序列在对病毒含量很低的样品进行扩增时只产生了微量的PCR产物，或易产生错误片段，需进一步进行套式扩增。

综上所述，本研究通过对CEV和KHV三重PCR检测方法的初步建立，明确了反应体系和反应程序，适用于检测病毒含量较高或发病状况下的锦鲤样品，针对病毒含量较低的样品，弥补套式PCR的缺陷。与荧光PCR相比，扩增产物可直接测序进行序列分析。该方法在引物序列方面还需改进，需要在以后的工作中积累大量的阳性样品以及序列信息，力求找到更加保守的序列和更通用的引物。本研究的建立为CEV和KHV检测方法的研究提供了重要依据，为更好地检测这2种常见鱼类疫病奠定了一定的基础。