高效液相法测定西藏红景天饮料中红景天苷

张沙沙 曹叶伟 李 姣 朱肖翔 刘亚洲 姜静雨

（西藏自治区食品药品检验研究院 西藏拉萨 850000）

1 前言

红景天是景天科多年生草本植物，主要分布在西藏、东北、新疆、四川等省份，是一种药食兼用植物，常以根茎入药[1]。研究表明红景天具有预防肿瘤、增强免疫力、抗疲劳及缓解压力、抗缺氧[2]、抗病毒[3-5]等功效。其主要功能成分为红景天苷[6]。近年来，以红景天苷为主要功效成分开发的产品主要包括红景天保健品及中成药、红景天饮料、红景天发酵食品[1]等。目前，对红景天及其产品中红景天苷的提取方法主要包括超声辅助水提、乙醇提及甲醇提[7-8]等，近年来，有学者通过相关研究证明使用一定比例甲醇水提取时，提取率最高[9]。红景天苷的测定方法主要有高效液相色谱法[10]、比色法[11]、薄层扫描法等[12]，相比于其他方法，高效液相色谱法能更有效地分离出目标物中的红景天苷，避免红景天中其他干扰物质对结果的影响[13]，且前处理简单，分析速度快，应用范围广，重现性好，准确度高。西藏红景天饮料主要以红景天的粗浸提液调配制成[14]，质地稍浑浊，有少许红景天根茎沉淀，使用保健食品产品技术要求中规定的饮料中红景天苷测定方法难以将该饮料中红景天苷充分提取出来，从而影响测定结果的准确性。为了解决上述难题，本研究通过单因素对比试验与响应面试验设计确定了高效液相色谱法测定红景天饮料中红景天苷的提取试剂、提取时间、提取温度及最佳流动相，建立了西藏红景天饮料中红景天苷测定的高效液相色谱方法。

2 材料与仪器

2.1 材料

红景天饮料（西藏屋脊之宝生物科技有限公司生产）；甲醇（色谱级，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；怡宝纯净水（华润怡宝饮料（中国）有限公司）。

2.2 实验仪器

超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；台式高速离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；高效液相色谱仪（配有PDA检测器，岛津企业管理 （中国）有限公司）；安捷伦C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司）。

2.3 单因素实验设计

准确吸取10.0 mL充分混匀后的红景天饮料，加入适量溶剂，超声提取后定容、离心，使用0.45μm有机滤膜过滤后，通过高效液相色谱仪测定红景天苷含量。首先，通过单因素对比试验确定最佳流动相，再考察提取溶剂比例、提取时间与温度对测定结果的影响。

2.4 响应面的组合试验设计

在单因素试验的基础上，确定以提取试剂比例（A）、提取时间（B）、提取温度（C）3 个因素为自变量，以目标峰（红景天苷）面积为响应值，通过响应面分析对红景天苷的测定条件进行充分优化。试验因素和水平见表1。

表1 红景天苷测定试验的因素与水平

3 方法与结果分析

3.1 最佳流动相的确定

安捷伦 C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30℃，检测波长215 nm，进样量10 μL，总流速为1 mL/min，分别以20%、40%、60%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行等度洗脱，测定同一浓度红景天苷标准品和同一样品，通过红景天苷出峰情况和峰面积大小，确定最佳流动相。详见图1～图3及表2。

图1 流动相为20%甲醇水溶液（V/V）时的红景天苷标准品与样品色谱图

图2 流动相为40%甲醇水溶液（V/V）时的红景天苷标准品与样品色谱图

图3 流动相为60%甲醇水溶液（V/V）时的红景天苷标准品与样品色谱图

表2 红景天苷在不同流动相下的出峰情况

由图1可以看出，当流动相为20%甲醇水溶液（V/V）时，红景天苷与其他杂峰的分离效果较好，且峰形较为理想，由图2～图3可以看出，当流动相分别为40%、60%甲醇水溶液（V/V）时，红景天苷与其他杂峰的分离效果差。结合表2可看出，红景天苷随着流动相中甲醇浓度的增高，出峰时间虽在逐步提前，但峰面积在逐步减小。综上分析可知，红景天苷的最佳流动相为20%甲醇水溶液（V/V）。

3.2 提取溶剂的确定

取50 mL容量瓶5只并编号，吸取20 mL混匀后的样液于各容量瓶中，分别加入0%、25%、50%、75%、100%的甲醇水溶液（V/V）超声提取20 min后，过滤，上机，确定最佳红景天苷提取溶剂。

图4 提取溶剂对红景天苷峰面积的影响

由图4可以看出，以甲醇水溶液作为提取溶剂对样品进行处理时，甲醇含量在0%～50%，随着甲醇含量的增大，红景天苷面积也随之增大，当甲醇含量为50%时达到最大，随后，随着甲醇浓度的持续增大，红景天苷峰面积反而在减小，但减小幅度缓慢，因此，确定以50%甲醇水溶液（V/V）作为样品的提取溶剂。

3.3 超声提取时间的确定

取50 mL容量瓶7只并编号，吸取20 mL摇匀后的样液于各容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V），以 0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min分别对其超声提取后，过滤，上机，确定样品的最佳超声提取时间。

图5 超声时间对红景天苷峰面积的影响

由图5可以看出，样品的超声提取时间在0～20min之间时，红景天苷峰面积呈上升趋势，在20 min时达到最大，随后，提取时间继续增加，红景天苷峰面积的增长幅度基本趋于平稳。因此，确定样品的最佳超声提取时间为20 min。

3.4 超声提取温度的确定

取50 mL容量瓶5只并编号，吸取20 mL摇匀后的样液于各只容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V），以 25、35、45、55、65℃分别对其超声提取 20 min 后，过滤，上机，确定样品的最佳超声提取时间。

图6 超声温度对红景天苷峰面积的影响

由图6可以看出，样液的提取温度在0～45℃时，红景天苷峰面积在逐步增大，表明饮料中红景天苷的提取量也逐渐增大，随着提取温度的持续增加，红景天苷的提取量反而在缓慢减小。因此，样品的提取温度选择45℃。

3.5 响应面试验结果与分析

根据表3的试验数据，利用Design-Expert8.0.6软件进行设计分析，得出了3个因素和目标峰面积之间的回归方程为：

表3 样品中红景天苷的提取条件响应面设计及结果

由表4 可看出，在此模型中，0.0001＞P＞F，表明模型回归极显著；失拟项不显著，说明试验数据与模型拟合度良好，通过对上述模型分析得出，各因素都极显著，说明各试验因子与响应面的关系中，因变量和全体自变量的关系显著，r2=0.9973，这充分说明响应面的变化有99.73%来源于所选的变量 （提取溶剂、提取时间、提取温度）。综上分析，回归模型的拟合度良好，可利用该回归方程对样品中红景天苷的提取条件进行分析和优化。

表4 方差分析表

应用BOX-Behnken分析计算，得出样液中红景天苷最佳提取条件为：提取溶剂为50%甲醇水溶液（V/V）、超声提取时间与温度分别为 20 min、45℃，预测红景天苷的峰面积为310145。在此条件下进行6次重复性试验，红景天苷的平均面积为309 697，与预测值得误差为1.4%，小于5%，预测值与试验值之间的拟合度良好，表明采用BOX-Behnken试验设计所得的样品中红景天苷的最佳提取条件可行。

3.6 标准曲线和供试样液的制备

精密称取纯度为98.8%的红景天苷标准品8.0162mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容刻度，即得红景天苷浓度为0.396 mg/mL的标准储备液，再分别精密吸取标准储备液 30 μL、65 μL、150 μL、300 μL、650 μL，以50%（V/V）甲醇水溶液稀释成浓度为0.01188、0.02574、0.0594、0.1188、0.2574 mg/mL 的溶液，上机，绘制标准曲线。

准确吸取样液于容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V）后，以45℃超声提取20 min后，再以50%甲醇水溶液（V/V）定容至刻度，混匀，以3 000 r/min离心3 min后，经0.45 μm有机系滤膜过滤，上机，通过标准曲线计算样品中红景天苷的含量。

由图7可知，红景天苷含量在0.01188～0.2574mg/mL范围内具有良好的线性关系，其标准线性方程为y=1E+07X+7986，r2=0.9999。

图7 红景天苷标准曲线

3.7 精密度实验

将浓度为 0.01188mg/mL、0.0594mg/mL、0.2574mg/mL的红景天苷标准品在上述色谱条件下，分别连续进针6次，测得的红景天苷面积与精密度如表5所示，各浓度进针6次所得峰面积的相对标准偏差均低于5%，这表明优化后的实验方法精密度良好。

表5 精密度实验结果表

3.8 重现性试验

选取同一样品，按照2.6方法制备6份供试液，在上述色谱条件下，进样，所测得的红景天苷浓度分别为0.0240mg/mL、0.0250mg/mL、0.0250mg/mL、0.0240mg/mL、0.0250mg/mL、0.0240mg/mL，平均值为 0.0245 mg/mL，相对标准偏差为0.05%，表明该方法重现性良好。

3.9 加标回收试验

精确吸取同一样液9份于容量瓶中，每份吸取体积为20 mL，加入不同浓度红景天苷对照品溶液，并以50%甲醇水溶液（V/V）定容至刻度，按照2.6方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进样，测定红景天苷含量，计算加标回收率，验证评价方法的准确性。

表6 加标回收实验表

由表6可知，向样品溶液中所加的3个浓度水平红景天苷对照品的回收率都不小于90%，平均回收率为95.4%，相对标准偏差为1.1%，小于1.5%，回收率良好，表明该方法准确度较高。

4 结论

本研究通过对比试验得到红景天苷的最佳色谱条件为：柱温30℃、检测波长215 nm、进样量10 μL、流速1.0 mL/min，流动相为20%甲醇水溶液（V/V）。采用BOX-Behnken试验设计和响应面分析法得到红景天饮料中红景天苷的最佳提取条件为：提取溶剂为50%甲醇水溶液（V/V）、提取时间与温度分别为20 min与45℃。经外标定量法验证后发现：该测定方法不仅准确度高，且加标回收率良好，适用于今后红景天类食品及保健品中功效成分的测定。