咖啡特异性实时荧光PCR检测方法的建立

梁颖婕 冼钰茵 刘婧文 黄成栋 奚星林 凌莉*

（1.广东检验检疫技术中心 广东广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室）

1 前言

咖啡是全球最受欢迎的食品之一，为世界三大饮料之首，是国际贸易中十分重要的原料产品，主要有阿拉比卡和罗布斯塔两个品种[1]。在供不应求的情况下，不法商人为有利可图而在咖啡中掺入玉米、大麦、小麦、大豆、大米等物质[2]。目前，鉴别咖啡的方法有物理法[3]、化学法[4,5]、色谱质谱法[6]、光谱法[7]和分子生物法[8]等。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，基于DNA的物种鉴别方法（如PCR技术等）已发展成为分析化学技术的有效补充方法，它具有方便、准确、迅速、简洁的特点，越来越多地应用于咖啡检测中[9,10]。Ferreira等[11]设计了咖啡的特异性引物对，用实时荧光PCR染料法检测咖啡成分。

实时荧光PCR探针法也是一种快速鉴别物种的方法，而迄今为止，未有相关研究使用探针法快速鉴别咖啡物种。本实验旨在设计出咖啡的物种特异性引物与探针，建立一种快速、准确检测咖啡成分的方法。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

实验的咖啡样品见表1，购自广州各大超市；黄豆、黑豆、绿豆、红豆、眉豆、花生、小米、荞麦、小麦、玉米、苹果、梨、橙子、红枣、核桃、木瓜、甜菜、大米、米粉、鸡、鹅、水鸭、水牛、绵羊、猪、马、家兔、罗非鱼、牡蛎、虾均购自广州永旺超市；SD大鼠、转基因大豆来自本实验室，用于咖啡的特异性检测。

QuickGene DNA tissue kit S，日本KURABO公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega公司；MagDEADNA200 （GC）， 日本 PSS公司；Takara Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，宝生物工程（大连）有限公司。

2.2 主要仪器与设备

表1 实验咖啡样品

2.3 实验方法

2.3.1 DNA提取与制备

将2.1提到的样品用研磨机或搅拌机均质研磨成粉状或肉碎状。使用2.2中的3种DNA提取试剂盒提取咖啡样品的基因组DNA，其余阴性对照样品用Magtration12GC PLUS核酸提取仪搭配MagDEADNA200（GC）试剂盒提取。提取方法详见试剂盒操作说明书。使用Nano核酸蛋白含量测定仪测定基因组DNA的浓度。用1×TE缓冲液作系列稀释，使咖啡 DNA 浓度为 10.00 ng/μL、5.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.50 ng/μL、0.10 ng/μL、0.01 ng/μL。用非咖啡物种的DNA （大豆DNA）梯度稀释咖啡DNA，得到10.00% 、1.00% 、0.10% 、0.01% 的 DNA 溶 液 。25 μL体系内加1 μL的DNA，用于进行DNA检测灵敏度检测。

2.3.2 引物及探针的设计与合成

本研究参考Denoeud F对咖啡基因组的分析[12]，通过在NCBI数据库上反复寻找筛选，找到了咖啡的黄苷甲基转移酶（Xanthosine Methyltransferase 1，XMT1）基因（Gene Bank:JX978514.1 和 JX978509.1）上的特异性片段，使用软件Primer Express设计出引物和探针，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物为PAGE级，探针为HPLC级。咖啡引物和探针序列分别为：

2.3.3 实时荧光PCR反应

实时荧光 PCR 反应体系（25 μL）：2×PCR Premix Extaq 12.5 μL，引物（10 μmol/L）及探针（10 μmol/L）各 1μL，参比荧光 ROX（50×）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，用 ddH2O 补足体系。扩增条件为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，共 40 个循环。

3 结果

3.1 咖啡引物与探针XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P的特异性验证

按照2.3的方法，用咖啡引物与探针XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P扩增C1～C7编号的咖啡豆和其他非咖啡样品，进行咖啡引物与探针的特异性验证。实验结果如图1所示，本套引物与探针对7种咖啡豆的DNA均有明显的扩增，对其他粮食作物、禽类、海鲜和哺乳类动物都无明显扩增，说明咖啡引物与探针XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P具有物种特异性。

3.2 咖啡引物与探针XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P检测灵敏度分析

咖啡引物与探针的检测灵敏度，指在35个循环内对咖啡基因组DNA的检测阳性的最低DNA量。从图2A可知，本检测体系对咖啡基因组DNA的检测敏感度为0.1 ng/μL，即建立的实时荧光PCR检测方法的定性最低检测限为0.1 ng/μL。用初始等浓度的大豆DNA梯度稀释咖啡DNA，进行实时荧光PCR的灵敏度检测，结果如图2B所示，实验灵敏度达到0.1%（DNA浓度百分数）。

3.3 稳定性分析

图1 咖啡引物探针XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P实时荧光PCR特异性检测

图2 咖啡DNA实时荧光PCR的灵敏度检测

选取浓度分别为 10.0 ng/μL、1.0 ng/μL、0.1 ng/μL的咖啡DNA作模板，25 μL体系内加1 μL的DNA，每个浓度做20个平行，进行稳定性实验。结果如图3所示，本实验体系能稳定检测出咖啡DNA。

3.4 市售咖啡的应用检测

选取市售的咖啡进行实时荧光PCR反应，评价本实验咖啡引物探针的实际应用检测效果。实验结果如图4所示，本检测体系的咖啡引物探针对来自世界各地的16种市售咖啡豆（C1～C16）均有明显扩增。然而对速溶咖啡（C17～C20）的扩增曲线不明显，在咖啡瓶装饮料（C21～C24）中也未出现扩增曲线。

图3 咖啡DNA实时荧光PCR稳定性检测

图4 市售咖啡豆和咖啡饮料的实时荧光PCR检测

4 讨论与分析

近年来，PCR及其衍生技术的快速发展大大推动了物种鉴定技术的快速发展。Ferreira等设计了咖啡特异性引物对，用实时荧光PCR染料法建立标准曲线，定量检测咖啡中的掺假谷物成分。而Taqman实时荧光PCR探针法具有重复性好、特异性强、线性范围广的优点，在各个领域有着广泛的应用[13]。建立探针法定性检测咖啡成分，对日后更加准确地定量检测咖啡掺假有重要的意义。另外，还可以为日后鉴别阿拉比卡与罗布斯塔两个咖啡物种提供分子生物学技术支持。

咖啡的XMT1酶是咖啡物种中咖啡因生物合成途径上的关键酶，也是咖啡特有的蛋白质，阿拉比卡和罗布斯塔两种咖啡都含有此酶的基因。本实验选取XMT1基因上的特异性片段设计了一套引物及探针，进行咖啡成分的实时荧光PCR定性检测，结果表明，这组引物探针可以特异性的扩增咖啡，与常见豆类、谷物、蔬菜、水果以及动物均无交叉反应，具有咖啡物种特异性。在DNA百分比水平上，这组引物探针的检测灵敏度为0.1%；在DNA质量灵敏度的测试中，检测灵敏度为0.1 ng/μL。

在提取咖啡DNA的方法研究上，Martellossi C等[14]和Spaniolas S等[15]使用了多种DNA提取方法来获得各种咖啡豆、咖啡粉和速溶咖啡的DNA。参照先前文献，对于市售咖啡的检测，本实验同时使用了3种DNA提取试剂盒 （Kurabo、Promega和PSS）提取咖啡样品的DNA。提取效果取决于样品的状态，在咖啡豆中可以提取出高质量和数量的DNA。然而在速溶咖啡和咖啡饮料中未能得到合适数量和质量的DNA，实时荧光PCR检测结果为阴性。可能由于速溶咖啡还有其他含咖啡产品的咖啡含量相对较少，加之制作工艺对咖啡DNA有破坏降解作用，造成DNA提取质量和数量不理想，检测结果不如预期。现有的提取方法不一定适合咖啡衍生产品的DNA提取，因此，日后需要对工业加工的咖啡产品DNA提取方法作进一步研究。

本研究建立的咖啡物种特异性实时荧光PCR定性检测方法具有稳定性好、特异性强和灵敏度高的特点，通过一系列的验证实验，说明PCR定性检测体系在分子水平鉴定咖啡是可行的。此方法能快速、准确对咖啡进行定性检测，为今后利用分子生物学方法检测咖啡掺假提供技术依据。