没食子提取物对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用*

美热古丽·依米提，曹春雨，2，窦勤，李治建，斯拉甫·艾白

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种临床常见且原因不明的炎性疾病，又称非特异性溃疡性结肠炎，主要累及到直肠和乙状结肠，病理表现主要是结肠黏膜和黏膜下层的慢性炎症细胞的浸润、隐窝脓肿以及腺体和上皮的损伤为主要特征[1]。临床上常以腹泻、黏液脓血便、里急后重和腹痛为主要症状，除此外还有发热、体质量下降、贫血、关节疼痛、皮肤黏膜损伤、肾结石和骨质疏松等多种临床表现[2]。没食子是没食子蜂科昆虫没食子蜂(Cynips gallae-tinctorice Oliv)的幼虫，寄生于壳斗科植物没食子树(Quercus infectoria Oliv.)幼枝上所产成的虫瘿，是维吾尔医常用药材，具有清除异常体液的作用，临床用于治疗溃疡性结肠炎，具有敛肠、消炎止泻、开通肠阻、促使溃疡愈合的作用，疗效显著，但其治疗UC的作用机制尚未明确。在UC患者中，白细胞介素-6(IL-6)浓度均明显高于非病变部位[3-9]，IL-6通过激活雅努斯激酶(Janus kinase，JAK)蛋白，间接地导致STAT3高表达，加速溃疡癌变[10-15]，JAK抑制剂可在一定程度上缓解UC炎症反应。笔者通过研究没食子提取物对上述炎症递质及相关基因表达的影响，探讨其抗UC的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK(新)2016-0001。实验动物喂养环境：新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所SPF级动物房。饲养在塑料笼内，每笼饲养性动物不多于5只，自由饮水。相对湿度：40%～70%，室温：20～26 ℃，光照12 h，实验正式开始前经检疫和适应性饲养，选择健康动物进行造模。

1.2试剂和药品 没食子提取物，没食子药材(批号：20161112)购自新疆维吾尔自治区维吾尔医院，新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂科希尔艾力·吐尔逊研究员鉴定为正品。提取方法：取没食子，粉碎成粗粉，加8倍量水浸泡1 h后煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，滤过，滤液真空干燥得浸膏，称质量，计算得率为75%。大鼠IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，批号：230671122)；大鼠JAK ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，批号：GR201801-1)；DEPC水(上海生工生物工程有限公司，批号：D424BA005)；反转录试剂盒(Thermo公司，批号：00374923)；PCR Master MIX(Thermo公司，批号：1706549)；Stat3、IL-6、β-actin(上海生工生物工程有限公司)；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇均为分析纯。

1.3主要仪器 自动血液分析仪(Thermo公司)；MuitiskanGo型酶联免疫检测仪(Thermo公司)；QGARD00R1型超纯水纯化系统(Q-Gard 公司)；WH-25型恒温培养箱(WIGGENS公司)；C1000 touch型PCR仪(Thermo公司)；CFX96型荧光定量PCR仪(Thermo公司)；ND1000型核酸蛋白测定仪(美国NanoDrop公司)；QGARD00R1超纯水纯化系统(Q-Gard公司，Lot：F4DA29061)；SC-3610型离心机(科大创新股份有限公司中佳分工公司)；ND1000型核酸蛋白测定仪(美国NanoDrop公司)。

1.4造模与分组 取健康SPF雄性SD大鼠80只，适应性饲养1周后，按体质量采用分层法随机抽取16只为正常对照组，剩下的64只，采用2，4，6三硝基甲苯磺酸(TNBS)一次性局部灌肠制备UC大鼠模型。造模过程：将动物禁食12 h后，采用0.5%戊巴比妥钠 0.5 mL·(100 g)-1腹腔注射麻醉，将由肛门轻缓插一直径2.7 mm长约37 cm的橡胶导尿管入直肠深在6～8 cm处注入制备好的造模液，注入造模液后大鼠倒置30 s ，每只0.5 mL·(100 g)-1，让动物保持俯卧位自然醒的状态[16-21]。造模后观察一般情况，包括饮食、体质量、皮毛、大小便、活动情况、精神状态等并作观察。造模标准采用参考文献公认的标准，造模可慢性炎症性肠疾(inflammatory bowel disease，IBD)造模后1～3 d出现稀便或脓血便，解剖可见结肠部位溃疡性病变视为模型成功，并伴有精神萎靡、毛发色泽暗淡、活动减少，反应变慢等全身改变[17-21]。造模成功后，分为模型对照组、美沙拉嗪组(美沙拉嗪150 mg·kg-1)，没食子提取物小剂量组(150 mg·kg-1)、没食子提取物大剂量组(300 mg·kg-1)，每组16只。给药体积为1 mL·(100 g)-1，每天一次，连续2周。给药结束后，腹主动脉取血，取距肛门8～10 cm的结肠作病理检查。

1.5血清IL-6、JAK的测定 IL-6的检测：严格按照IL-6 ELISA说明书进行测定。JAK的检测：严格按照JAK蛋白ELISA试剂盒进行检测。

1.6RT- PCR法检测IL-6、STAT3 mRNA的表达

1.6.1RNA提取 组织标本放入液氮中充分研磨至粉末，研磨后置于EP管中加Trizol 1 mL，混匀，室温放置5 min，加入0.2 mL的三氯甲烷剧烈摇荡15 s，室温静置5 min；4 ℃12 000 r·min-1，10 min，取上层水相于一新的EP管中，加入异丙醇0.5 mL，室温放置10 min，12 000 r·min-1，10 min离心，弃去上清液；加入75%乙醇1 mL清洗。4 ℃、12 000 r·min-1，离心5 min后弃去上清，重复操作一次；弃去上清液，室温或真空干燥5～10 min；加量DEPC水溶解RNA(30 μL)，取RNA 1 μL进行定量纯度的鉴定，合格后进行PCR反应。

1.6.2逆转录合成cDNA 核酸定量仪测定RNA浓度，取RNA 总量1 μg，配制逆转录反应体系：将Oligo dT 1 μL、dNTP 2 μL、ReverAid 1 μL、RNA inhibitor 1 μL、5×Buffer 4 μL、RNA和ddH2O 共11 μL加入无Rnase的PCR管中，42 ℃加热60 min，再70 ℃ 5 min后，-20 ℃保存备用。

1.6.3实时荧光定量PCR反应 PCR反应体系20 μL：包括dd H2O 8 μL、2×Master Mix 10 μL、上下游引物1 μL及cDNA 1 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸30 s，扩增40个循环。目标引物序列和内参引物序列见表1。

2 结果

2.1没食子提取物对UC大鼠血清IL-6和JAK含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组 IL-6水平和JAK蛋白含量均升高(P<0.01)；与模型对照组比较，美沙拉嗪组、没食子提取物小、大剂量组IL-6 水平和JAK蛋白含量降低(P<0.05)。见表2。

表1 目标引物序列和内参引物序列

表25组UC大鼠血清IL-6和JAK含量的比较

Tab.2ComparisonofIL-6levelandJAKcontentinserumamongfivegroupsofUCrats

组别IL-6(n=16)JAK(n=8)正常对照组121.00±30.36∗11038.02±270.01模型对照组232.00±20.481488.24±181.29∗1美沙拉嗪组162.10±5.11∗21220.94±116.22∗2没食子提取物 小剂量组157.66±9.53∗21427.70±207.71 大剂量组144.85±10.09∗21238.01±83.09∗2

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

2.2没食子提取物对UC大鼠溃疡组织IL-6、STAT3基因的影响 与正常对照组比较，模型对照组IL-6、STAT3基因表达升高(P<0.01)；与模型对照组比较，美沙拉嗪组、没食子提取物大剂量组IL-6表达降低；美沙拉嗪组和没食子提取物小、大剂量组STAT3表达均降低(P<0.05)。见表3。

3 讨论

三硝基苯磺酸所诱导的结肠炎模型因其比较接近于人类又有较好的重复性而被普遍使用，是目前研究的一个重要模型[22]。三硝基苯磺酸作为一种半抗原物质，与结肠膜组织中的大分子组织蛋白结合，形成一种完全抗原，进一步引起机体异常的免疫反应从而诱导肠炎的发生。其致病机制为损伤上皮屏障后由免疫系统介导其疾病的发展且病理及组织学改变均类似于人类炎症性肠病。在UC患者病变结肠组织中，IL-6浓度均明显高于非病变部位[3-9]，IL-6通过激活JAK蛋白，间接地导致STAT3高表达，加速溃疡癌变[10-15]。STAT3是在UC中起重要作用，研究显示，STAT3的激活在特异性和非特异性免疫中起明显不同的作用，它与致病及炎症程度相关[23-27]。细胞生长、分化、增殖和免疫调节等多个关键的生物过程都有JAK/STAT信号通路在参与[28-30]。JAK/STAT信号通路还与UC等多种疾病的发病机制密切相关。IL-6细胞因子刺激信号可诱导激活JAK/STAT信号通路，调节细胞核内相关基因的表达，引发相关细胞反应。JAK在炎症失调中发挥重要作用，JAK抑制剂可在一定程度上缓解UC炎症反应。而高表达的IL-6，可激活JAK蛋白，增加STAT3表达[31]。研究结果显示，没食子提取物能抑制IL-6的分泌。说明没食子提取物能有效的提高单核/巨噬细胞功能，减少致炎因子的释放。除了炎症反应中对促炎递质的分泌具有抑制的作用，还对机体正常免疫防御功能中又有促进作用、发挥其双向调节功能。

表35组UC大鼠结肠组织IL-6、STAT3mRNA相对表达量的比较

Tab.3ComparisonoftherelativemRNAexpressionofIL-6andSTAT3incolonsamongfivegroupsofUCrats

组别IL-6STAT3正常对照组1.56±0.560.79±0.24模型对照组11.13±14.83∗16.07±1.25∗1美沙拉嗪组4.70±3.62∗22.17±0.69∗2没食子提取物 小剂量组9.73±6.244.57±1.18∗2 大剂量组5.60±2.20∗22.56±1.83∗2

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

JAK是一类重要的酪氨酸蛋白激酶(PTK)，JAK2 是 JAK 家族中一个重要成员[32]；STAT(signal transducer and activators of transcription)是信号转导和转录激活因子的简称，是一类既具有信号传导功能又有转录活化癌基因编码功能的细胞质蛋白，可以被许多肽类蛋白如生长因子和细胞因子激活[33]。JAK/STAT信号通路在溃疡到癌症的疾病的发展及研究中已成为肿瘤治疗的靶点，发现多种人类肿瘤如结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等存在异常活化状态的STAT3。IL-6 等细胞因子与其特异性受体结合后，JAK2 通过 FERM 结构域与受体相结合并被磷酸化激活，磷酸化的 JAK2 使 STAT3 被磷酸化而活化，活化的 STAT3 形成二聚体并暴露其核定位信号，从而由胞浆转移到胞核，与其他转录调控因子协同调节靶基因的表达，进而影响细胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理过程。STAT3的激活在人体主要的恶性肿瘤细胞中具有持续高表达的特点，持续激活的STAT3可促进肿瘤细胞无限制生长、抑制肿瘤细胞的凋亡、刺激肿瘤组织内部血管的生长等，这些变化都会加重肿瘤患者的病情。本研究表明，没食子提取物能抑制IL-6、STAT3的逆转录水平，也能有效抑制IL-6促炎细胞因子的分泌。RT-PCR分析结果可得，没食子提取物也能有效抑制IL-6、STAT3的逆转录水平。提示没食子提取物能有效抑制巨噬细胞功能，减少巨噬细胞致炎细胞因子IL-6等的释放，阻断JAK2/ STAT3通路的异常磷酸化，达到抑制炎症加重的目的。本研究证实没食子提取物对促炎介质有抑制作用，可通过降低UC大鼠模型血清IL-6、JAK水平及其溃疡组织IL-6、STAT3基因表达发挥抗UC作用。