鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白的真核表达及其免疫保护效力分析

周陈陈，梁立滨，赵青青，黄山雨，李奇兵，王广文，李俊平，赵玉辉，曾显营，施建忠，李呈军，陈化兰，姜 丽

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

流感病毒是重要的人兽共患病病原。其感染的宿主广泛，不仅感染禽类，还可以感染多种哺乳动物(如猪、犬、猫、虎、熊猫、牛和海豹等)和人类，可以引发禽流感(AI)以及人的季节性流感和偶尔的流感大流行。2013年初，我国发生人感染H7N9 流感疫情，2017年初突变为对家禽具有高致病性的病毒株，截至目前，已累计导致1 567 人感染，615 人死亡。

流感病毒根据表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，分为不同亚型。目前，已经发现的A 型流感病毒(Influenza A virus，IAV)包括有18 种HA 亚型和11 种NA 亚型[1-2]。在流感病毒编码的蛋白中，以HA 蛋白的研究最为深入，HA 蛋白在决定流感病毒抗原性、病毒侵入宿主细胞等方面发挥重要作用，NA 蛋白则帮助成熟的子代病毒从宿主细胞表面释放[3]。流感病毒的HA 中存在抗原决定簇，抗原决定簇是一些能够激发宿主产生抗流感病毒抗体的氨基酸区域，抗原决定簇内氨基酸突变可以导致流感病毒的抗原性发生改变。HA 蛋白是宿主获得性免疫系统识别的主要对象，因而成为疫苗研制的主要靶标。

国际上主要通过加强流行病学监测，采取疫苗免疫来防控流感病毒的传播。目前在AI 的防控中广泛使用的疫苗主要是全病毒灭活疫苗，该疫苗抗原成分全，免疫原性良好，但也存在依赖鸡胚大量供应、干扰流行病学监测等缺点，且不断有新变异株出现，需要不断更新疫苗种毒株。此外，对于珍稀动物和禽类的防疫，需要开发新的疫苗研制策略[4-6]。目前HA 蛋白广泛应用于亚单位疫苗的研发中[7-8]，已有研究表明，在细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等多种表达系统中表达的HA 蛋白均有活性，利用HA 蛋白研制基因工程疫苗在AI 防控中发挥着重要的作用。杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，相比其他表达系统，其表达的外源蛋白能够模拟其天然构象，较好地诱发机体的免疫应答。目前，杆状病毒表达系统已经发展成为一种高效成熟的外源蛋白表达系统[9]。亚单位疫苗具有易于规模化生产、安全、便捷等优点。目前，针对养殖业危害较大的H5N1 及H7N9 亚型病毒的H5-HA 及H7-HA 重组亚单位疫苗已有报道[10-11]，本研究中选取杆状病毒表达系统对我国分离的一株鸭源低致病性H7N9 流感病毒的HA 进行了基因克隆并表达、纯化了具有活性的重组蛋白，并以SPF 鸡评价了重组蛋白的免疫保护效力，该方法所表达的蛋白对该病毒具有完全保护，可以作为重组亚单位疫苗的候选抗原蛋白。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物 A/Duck/Fujian/S4170/2014 株H7N9 亚型禽流感病毒(AIV)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存；pFastBac1 载体、pMD18T-HA(含有H7N9 病毒HA 基因开放阅读框)、SF9 昆虫细胞、High Five 细胞由本实验室保存；各种限制性内切酶、昆虫细胞培养基及CellFectin II 转染试剂盒均购自Invitrogen 公司；H7N9 亚型AIV 的阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司；抗His 单克隆抗体(MAb)购自武汉三鹰生物技术有限公司；Ni Sepharose excel 树脂购自GE 公司；Alexa Fluor 488标记的山羊抗鸡IgG 购自Abcam 公司；DyLight 800标记的山羊抗鸡IgG(H+L)抗体购自KPL 公司；3 周龄SPF 鸡由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。H7N9 灭活疫苗Re-1 株为国家禽流感参考实验室制备，疫苗种毒为A/Prgeon/Shanghai/S1069/2013(H7N9)。

1.2 HA 基因的扩增及重组供体质粒的构建 根据AIV A/Duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)HA 基因序列(GI：1237086597)，采用Primer 软件设计引物扩增HA 抗原基因，上游引物HAF：5'-ATAAGAATGCG GCCGCTTATGGGATTCACATACAGCGGGATAAG A-3'，下游引物HAR ：5'-CCCTCGAGTTAGTGATG ATGATGATGATGTCC-3'。重组质粒鉴定的通用引物为M13 (M13F： 5'-GTTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')，引物由吉林库美生物科技有限公司合成。以pMD18T- HA 为模板，利用HAF/HAR 引物扩增H7N9 流感病毒HA基因(PCR 反应条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s、58 ℃15 s、72 ℃1 min 10 s，35 个循环；72 ℃10 min)，回收纯化目的片段。 将目的片段和pFastBac1 载体分别进行NotⅠ/XhoⅠ双酶切，将纯化回收的目的片段克隆于pFastBac1 载体中。热激法转化DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组质粒酶切测序验证，重组供体质粒命名为pFastH7HA。

1.3 HA 重组穿梭质粒的构建与鉴定 将pFastH7HA、pFastBac1 供体质粒分别转化至DH10Bac 感受态细胞，在含有卡那霉素(50 μg/mL)，庆大霉素(7 μg/mL)，四环素(10 μg/mL)，X-gal (100 μg/mL)和IPTG(40 μg/mL)的LB 平板上培养48 h，蓝白斑筛选，选取白色菌落，培养后碱裂解法小量提取重组杆粒DNA，以M13 通用引物进行PCR 检测，筛选阳性克隆杆粒，分别命名为BacmidH7HA、Bacmid，用于细胞转染。

1.4 重组杆状病毒的获得 参照CellFectinII 转染试剂说明书，分别将Bacmid-H7HA、Bacmid 转染生长状态良好的SF9 昆虫细胞，27 ℃恒温培养36 h～72 h，待出现细胞病变后，收集上清作为第一代重组病毒，记为P1。将细胞上清在SF9 昆虫细胞传4代，收集第4 代细胞上清，以1∶4 的比例加入P4 代重组杆状病毒，即将200 mL P4 代病毒加入800 mL的High Five 细胞中，27 ℃摇床120 r/min 旋转培养，获得HA 蛋白浓度较高的细胞培养上清和Bacmid 细胞培养上清。

1.5 HA 蛋白的纯化 将重组杆状病毒感染的High Five 细胞培养上清过亲和层析柱(Ni Sepharose excel 5 mL 亲和层析预装柱)，首先使用2 % Buffer B 即20 mM Imidazole 洗脱杂质蛋白，然后使用洗脱缓冲液30 % Buffer B 即300 mM Imidazole 洗脱目的蛋白，经过亲和层析初步纯化后，利用分子筛Superdex200 10/300 GL 在AKTA explore 中进一步凝胶过滤纯化，纯化后的HA 蛋白经BCA 蛋白定量试剂盒定量，并经SDS-PAGE 分析。

1.6 HA 蛋白表达的western blot 鉴定 将Bacmid-H7HA、Bacmid 转染SF9 昆虫细胞，感染72 h 后，收集培养上清，以1∶200 稀释的H7N9 AIV 阳性血清为一抗，以DyLight 800 标记的山羊抗鸡IgG (1∶10 000 稀释)作为二抗，以同样方法处理的正常SF9昆虫细胞蛋白样品作为阴性对照，western blot 检测HA 蛋白是否正确表达。

1.7 HA 蛋白的间接免疫荧光(IFA)鉴定 将重组病毒pBacH7HA 接种于生长状况良好的SF9 昆虫细胞，感染4 h 后，用PBST 洗涤3 次。用预冷的甲醇室温固定10 min，自然干燥。一抗为1∶100 稀释的H7N9 阳性血清，37 ℃孵育1 h，用PBST 洗涤3次。二抗为1∶500 稀释的Alexa Fluor 488 标记的山羊抗鸡IgG，37 ℃孵育1 h ，用PBST 洗涤3 次，置于荧光显微镜下观察结果。以同样方法处理的SF9 细胞作为阴性对照。

1.8 SPF 鸡免疫保护实验 取40 只3 周龄SPF鸡，每组10 只，分别为H7N9 常规灭活疫苗Re-1免疫组、HA 蛋白一次免疫组、加强免疫组和阴性对照组，Re-1 疫苗免疫组0.3 mL/羽，HA 蛋白使用弗氏完全佐剂乳化作为H7HA 蛋白免疫组，分别胸肌多点注射，免疫剂量为20 μg/ 羽；一免后两周使用H7HA 蛋白加强免疫，免疫剂量为15 μg/ 羽，同时对照组免疫相同剂量的PBS，同种条件下饲养。第一次免疫开始，间隔一周采血，根据国家标准(GB/T-18936-2003)进行HI 试验，测定免疫鸡血清抗体水平。二免后第二周，对所有免疫组和对照组鸡采用鼻腔感染途径同时攻击A/Duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)病毒，攻毒剂量为105EID50，攻毒后3 d、5 d、7 d、9 d 采集所有免疫组鸡和对照鸡喉头和泄殖腔拭子，进行病毒滴定。

1.9 病毒滴度测定 HA 检测方法根据国家标准(GB/T-18936-2003)进行。将采集SPF 鸡喉头及泄殖腔拭子按照10 倍系列稀释，每个稀释度接种3 枚10 日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养48 h 后检测各稀释度血凝阳性鸡胚数目，根据Reed-Muench 方法计算病毒的EID50。

2 结 果

2.1 HA 基因的PCR 扩增及重组Bacmid-H7HA 的PCR 鉴定 以pMD18T-HA 为模板，HAF/HAR 为引物，通过PCR 扩增得到约1 500 bp 的片段，与预期HA 基因大小相符(图1)。回收目的片段，将其克隆于pFastBac1 载体中，构建获得pFastH7HA 重组供体质粒。将pFastH7HA 转化至DH10Bac 感受态细胞，提取重组杆粒DNA，以M13F/M13R 通用引物PCR 鉴定，扩增得到与预期相符片段(图2)，表明重组杆粒Bacmid-H7HA 构建正确。

2.2 HA 蛋白表达的western blot 鉴定 将重组杆粒Bacmid-H7HA 转染SF9 昆虫细胞，HA 蛋白以分泌可溶形式表达；利用Ni Sepharose excel 树脂亲和层析纯化重组蛋白，重组蛋白经SDS-PAGE 电泳检测，HA 蛋白大小约为65 ku，未见明显杂蛋白条带(图3A)。蛋白纯度达到90 %以上满足亚单位疫苗的要求。Western blot 结果显示在65 ku 出现特异条带(图3B)，表明H7N9 HA 蛋白在杆状病毒中得到了正确表达。

图1 HA 基因PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of HA gene by PCR

图2 重组杆粒Bacmid-H7HA 的PCR 鉴定结果Fig.2 PCR verification of recombinant Bacmid-H7HA

图3 纯化的H7HA 重组蛋白SDS-PAGE 检测(A)及western blot (B)鉴定Fig.3 The purified recombinant protein H7HA analyzed by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.3 重组蛋白表达的IFA 鉴定 pBacH7HA 杆状病毒感染SF9 昆虫细胞，对HA 蛋白在昆虫细胞中表达进行IFA 检测。在荧光显微镜下观察显示，pBacH7HA 感染的SF9 细胞出现绿色荧光，而阴性对照未出现荧光(图4)，表明H7N9 的HA 基因在SF9 昆虫细胞中获得正确表达。

2.4 SPF 鸡免疫保护实验结果 对各组免疫的SPF鸡免疫后1 周、2 周、3 周和4 周采集的血清进行HI 抗体滴度检测。结果显示，H7HA 蛋白单次免疫后4 周，SPF 鸡血清中HI 抗体滴度为2 log2 ～3 log2；初次免疫后2 周加强免疫一次，加强免疫后2 周进行HI 抗体滴度测定，显示H7HA 蛋白免疫组在加强免疫后HI 抗体滴度则有显著提高，达到5 log2～6 log2。H7N9 常规灭活疫苗(Re-1)免疫组SPF 鸡免疫4 周后其HI 抗体滴度可达7 log2以上；SPF 对照组鸡HI 抗体滴度均为阴性(＜2 log2)(图5)。表明H7HA 蛋白免疫原性良好，可以作为亚单位疫苗的候选抗原。

图4 IFA 检测H7HA 蛋白在感染SF9 细胞中的表达(×40)Fig.4 Identification of H7HA in infected SF9 by IFA (×40)

图5 SPF 鸡HI 抗体效价的检测Fig.5 HI antibody titers in SPF chicken immuned with H7HA protein

2.5 SPF 鸡攻毒试验结果 对于随机分组的SPF鸡采用A/Duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)攻毒后，在14 d 的观察期内SPF 鸡均无死亡或特征性临床症状。SPF 鸡加强免疫后2 周进行攻毒保护试验，采集其咽喉拭子及泄殖腔拭子进行病毒滴定结果显示：在H7N9 病毒A/Duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)攻击后的整个观察期内H7HA 蛋白一次免疫组和加强免疫组SPF 鸡喉头及泄殖腔均不排毒，可以产生100 %免疫保护作用，且H7HA 蛋白两次免疫后可以诱导SPF 鸡产生较高水平的HI 抗体(5 log2)，而对照组在攻毒后第9 d 仍可在泄殖腔检测到病毒。H7N9 灭活疫苗Re-1 免疫组对SPF 鸡提供了100 %的免疫保护(表1)。攻毒保护试验结果表明鸭源H7N9 病毒的H7HA 蛋白免疫原性良好，免疫SPF 鸡后可以对其提供良好保护。

3 讨 论

杆状病毒表达系统是目前最常用的真核基因表达系统，被广泛应用于疫苗生产、药物开发、基因工程的研究中，目前已有数百个基因在该系统中高效表达。该系统具有多角体启动、表达量高，蛋白翻译后的修饰功能，宿主仅针对无脊椎动物，使用安全等多种优点。另外，杆状病毒自身也可以刺激机体的固有天然免疫应答， 通过依赖Toll 样受体9的(TLR9)/MyD88 信号通路，诱导机体产生干扰素等多种细胞免疫因子[12]。与其它疫苗相比，杆状病毒表达的蛋白可以直接定居在肌肉组织，直接转导抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞，免疫效果较好[13]。

表1 SPF 鸡攻击A/Duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)排毒情况Table 1 Virus shedding from SPF chickens infected with A/Duck/Fujian/S4170/2014

利用杆状病毒系统进行亚单位疫苗的生产已经比较成熟，HA 蛋白是AIV 的主要抗原蛋白，在病毒的致病力、感染性以及免疫保护中起着重要作用。本研究中对我国分离的一株鸭源低致病性的H7N9 AIV HA 基因进行了研究，将HA 因克隆至pFastBac1 载体中，构建了由GP67 信号肽、HA 胞外区、Thtombin 酶切位点、三聚体标签及His 标签构成的复合载体，转染SF9 昆虫细胞表达了高纯度的具有生物活性的HA 蛋白。通过western blot 和IFA 分析表明，该蛋白具有较好的反应原性。通过SPF 鸡的免疫试验，进一步验证该抗原蛋白的免疫效果及安全性。因此，本研究表达的HA 蛋白可以作为亚单位疫苗和诊断试剂的候选抗原，并且为进一步研究AIV HA 蛋白的功能奠定了基础。