发光二极管荧光显微镜在基层实验室检测分枝杆菌的价值

张学志 林百丰 裴新发 陈丽 彭英 唐鹭

萋尔-尼尔逊染色(简称“萋-尼染色”)为涂片染色镜检的标准方法，此方法因其快速、易操作、价格低廉、特异度高等优点成为结核病实验室广泛使用的主要诊断技术之一。但该方法敏感度较低，并且阅片时间较长，容易对患者造成漏诊。研究发现，荧光染色法较该方法的敏感度提高了约8%[1]，而特异度与其相当，镜检时间明显缩短，特别适用于标本量较大的基层结核病实验室。荧光染色法的主要缺点是传统荧光显微镜价格昂贵，需要暗室进行检测，影响其广泛应用。近年来，新的光源发光二极管(LED)应用于荧光显微镜上很好地解决了普通荧光显微镜的这些缺点。为探索在基层实验室推广使用此项技术的前景，笔者选择8个县级结核病防治机构(简称“结防机构”)对此项技术的应用进行了多中心评估，现报告如下。

资料和方法

1.研究对象：连续纳入2017年7月至2018年10月黑龙江省阿城、尚志、验收、宾县、杜蒙、林甸、泰来、甘南8个县级结防机构的初诊肺结核可疑症状者，共3770例，每例患者留取2～3份痰标本，共9079份，全部进行痰结核分枝杆菌固体培养。

2.试剂和仪器：各县级结防机构使用的荧光染色液、萋-尼染色液和酸性罗氏培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司；LED荧光显微镜为宁波舜宇仪器有限公司生产的EX30型。

3.试验方法：(1)痰涂片镜检：每份痰标本涂2张痰涂片，分别用萋-尼染色法和荧光染色法进行染色，操作方法参见文献[2]，同时进行检测并将检测结果进行登记，并记录镜检所用时间。由省级结核病预防控制中心每月抽取阳性涂片进行复核。(2)培养：对纳入的痰标本全部进行分枝杆菌简单法固体分离培养，操作方法参见文献[3]。(3)痰涂片保存：荧光染色涂片和萋-尼染色涂片正常保存在室温条件下，避免阳光直射。(4)质量控制：为保证镜检的质量，在正式启动前对8个县区的实验室人员进行严格培训，使其能够准确报告结果，培训结束后试运行1个月，并对实验室人员进行室间质量评价和室内质量控制，全部达标后才正式开始试验。

结 果

1.初诊患者阳性检出情况：萋-尼染色法和荧光染色法涂片镜检阳性率分别为11.41%(430/3770)和12.79%(482/3770)，固体培养阳性率为17.14%(646/3770)，三种方法检测阳性率比较差异有统计学意义(χ2=5602.10，P<0.01)。

2.两种染色方法的诊断价值评价：以痰培养结果为参照标准，萋-尼染色法和荧光染色法涂片镜检分枝杆菌的敏感度分别为61.46%和66.72%，特异度分别为 98.94%和98.37%。 萋-尼染色法约登指数为0.604，荧光染色法约登指数为0.651，见表1。

3.读片时间比较：两种不同的染色方法镜检每份痰涂片所用的时间不同，LED荧光显微镜镜检所用的时间明显低于普通光学显微镜镜检所用时间，差异有统计学意义(F=5670.80，P<0.01)，见表2。

4. 荧光染色阳性涂片常温避光保存情况：将LED荧光显微镜检测的1179张阳性级别不同的荧光染色涂片放入不透光的玻片盒内常温(22～25 ℃)存放，并避免阳光直射，进行4个月的连续观察，其中1～9条/50个视野涂片82张，+级328张，++级202张，+++级282张，++++级285张。第1～4个月出现定性错误[2]的依次为5张(0.42%；均为几条菌)、13张(1.10%；均为几条菌)、21张(1.78%；20张为几条菌，1张为+级)、27张(2.29%；25张为几条菌，2张为++级)。第1～4个月出现定量误差[2]的依次为10张(0.85%)、33张(2.80%)、65张(5.51%)、72张(6.11%)。

表1 萋-尼染色法和荧光染色法以痰培养结果为参照标准的检测效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%

表2 不同级别镜检结果应用两种染色方法显微镜检查读片时间的比较

注萋-尼染色显微镜检查结果分级标准：阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；条数：1～9条/300个视野；+：3～9条/100个视野，连续观察300个视野；++：1～9条/10个视野，连续观察100个视野；+++：1～9条/1个视野；++++：≥10条/1个视野。荧光染色LED显微镜检查结果分级报告标准：阴性：0条/50个视野；条数：1～9条/50个视野；+：10～49条/50个视野；++：1～9条/1个视野；+++：10～99条/1个视野；++++：100条及以上/1个视野

讨 论

本研究在黑龙江省8个县区级结防机构进行了荧光染色液LED荧光显微镜和萋-尼染色液普通光学显微镜镜检痰涂片效果的比较。结果显示，LED荧光显微镜镜检阳性率高于普通光学显微镜镜检，与丁北川等[5]的研究结果一致。同时，其他研究也显示LED荧光显微镜镜检阳性率较普通光学显微镜增加9%[1,7-11]。

两种镜检方法分别以痰培养结果为参照标准， LED荧光显微镜镜检敏感度为66.72%，普通光学显微镜镜检的敏感度为61.46%，与尚美等[6]报道结果一致；两种方法的特异度相当。而文献也曾报导LED荧光显微镜比普通光学显微镜镜检的敏感度有一定的提高，特异度基本无变化[1]。宋媛媛等[4]也报道LED荧光显微镜比普通光学显微镜镜检的敏感度有一定的提高。LED荧光显微镜镜检与痰培养的一致率为92.94%，大于普通光学显微镜镜检一致率，表明LED荧光显微镜镜检与固体培养法检测效能更接近。

对LED荧光显微镜与普通光学显微镜镜检不同级别阳性痰涂片和阴性痰涂片的读片时间进行分析发现，两种方法的镜检时间差异有统计学意义，前者比后者总体镜检时间缩短。这与宋媛媛等[4]报道的结果一致。

对所有荧光染色阳性痰涂片进行连续4个月的常温避光保存观察，发现随着时间的推移有部分阳性涂片出现褪色的情况，出现褪色的有27张，但1～9条/50个视野痰涂片褪色的有25张，+级痰涂片褪色的有2张，对++～++++阳性级别的痰涂片几乎无影响。荧光随着时间的推移会出现淬灭现象，可能由于不同的菌体对荧光淬灭的快慢不同造成。痰涂片内含菌量越少淬灭的速度越快。由于只是部分阳性级别低的涂片会出现荧光消失，这对使用LED荧光显微镜进行常规的实验室工作和痰涂片保存及质量控制影响并不大。

经过本次研究可以发现，LED荧光显微镜与普通光学显微镜镜检相比敏感度有一定提高，特异度相当；同时，LED荧光显微镜镜检可以提高痰涂片检测的阳性率，并大幅度降低了阅片时间，减轻实验室人员的工作量。但值得注意的是，没有阅读荧光显微镜经验的人员最好经过系统性的培训，并在有经验人员的协助下进行阅片。在痰涂片质量保证方面，由于北方温度和湿度没有南方高，只要避免阳光直射，直接将痰涂片放在不透明的玻片盒内室温保存，在进行盲法质量控制检查出现定性错误时对错误的痰涂片进行重新脱色复染即可。

综上，LED荧光显微镜镜检不仅可提高检测速度、检测阳性率、对实验室人员的要求不高、操作简单，且仪器设备价格较为低廉，适合在基层实验室进行推广。